नवजात माउस दिमाग के Striatal कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर के लिए Stereotaxic सर्जरी
Summary
हम एक घर का बना सिर के साथ stereotaxic सर्जरी के एक प्रोटोकॉल का वर्णन-नवजात माउस दिमाग के striatum में microinjecting रिएजेंट के लिए फिक्स्ड डिवाइस । इस तकनीक नवजात माउस दिमाग के विशिष्ट क्षेत्रों के ंयूरॉन कोशिकाओं में आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति देता है ।
Abstract
कई जीन भ्रूण दिमाग में व्यक्त कर रहे हैं, और उनमें से कुछ लगातार जंम के बाद मस्तिष्क में व्यक्त कर रहे हैं । इस तरह के लगातार जीन व्यक्त के लिए, वे विकास प्रक्रिया और नवजात दिमाग में शारीरिक समारोह को विनियमित करने के लिए कार्य कर सकते हैं । मस्तिष्क में विशिष्ट जीन के neurobiological कार्यों की जाँच करने के लिए, यह मस्तिष्क में जीन को निष्क्रिय करने के लिए आवश्यक है. यहां, हम नवजात समय खिड़कियों पर ट्रांसजेनिक चूहों के striatum में जीन अभिव्यक्ति को निष्क्रिय करने के लिए एक सरल stereotaxic विधि का वर्णन । AAV-eGFP-Cre विषाणु striatum दिवस (पी) 2 Ai14 ब्रेन सर्जरी द्वारा जन्मोत्तर रिपोर्टर जीन चूहों के stereotaxic में microinjected थे । tdTomato रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति P14 striatum में पाया गया था, loxP-AAV transduced कोशिकाओं में एक सफल Cre-striatal मध्यस्थता डीएनए पुनर्संयोजन का सुझाव. हम आगे microinjecting AAV द्वारा इस तकनीक को मांय-eGFP-Cre वायरस P2Foxp2fl/fl चूहों में । GFP और Foxp2 के डबल लेबलिंग से पता चला कि GFP-पॉजिटिव कोशिकाओं में immunoreactivity P9 में Foxp2 striatum का अभाव था, Foxp2-AAV-eGFP Cre transduced कोशिकाओं में striatal प्रोटीन के नुकसान का सुझाव देते हैं । एक साथ ले लिया, इन परिणामों Cre floxed चूहों के नवजात दिमाग में विशिष्ट ंयूरॉंस आबादी में stereotaxically microinjected AAV-eGFP-ट्रांसजेनिक वायरस द्वारा एक प्रभावी आनुवंशिक विलोपन प्रदर्शित करता है । अंत में, हमारे stereotaxic तकनीक नवजात माउस दिमाग में आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक आसान और सरल मंच प्रदान करता है । तकनीक केवल नवजात दिमाग के विशिष्ट क्षेत्रों में जीन को नष्ट करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह भी औषधीय दवाओं, न्यूरॉन अनुरेखक, आनुवंशिक रूप से संशोधित optogenetics और chemogenetics प्रोटीन, न्यूरॉनिक गतिविधि संकेतकों इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता और नवजात चूहे के दिमाग के striatum में अन्य रिएजेंट.
Introduction
संरचना और मस्तिष्क के समारोह के आधुनिक अध्ययन आम तौर पर ंयूरॉन कोशिकाओं में विशिष्ट जीन के आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है । विभिंन जीन के कार्यों की जांच करने के लिए, ट्रांसजेनिक को नॉकआउट और नॉकआउट सहित उत्परिवर्ती alleles, ले जाने वाले चूहों को नियमित रूप से उत्पंन किया गया है । Stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी वयस्क कुतर के लिए एक मानक विधि स्थानीय रूप से कुतर दिमाग के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए दवाओं, वायरस, अनुरेखकों और अन्य रिएजेंटों उद्धार करने के लिए1,2. ट्रांसजेनिक चूहों को stereotaxic ब्रेन सर्जरी लागू करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से जीन समारोह और माउस मस्तिष्क के विशिष्ट न्यूरॉन आबादी में न्यूरॉन गतिविधि में हेरफेर करने के लिए अनुमति देता है. सेल प्रकार-विशिष्ट हेरफेर मस्तिष्क3,4,5के जटिल तंत्रिका सर्किट में ंयूरॉन कार्यों को समझने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करता है ।
तंत्रिका तंत्र का विकास जल्दी भ्रूण चरणों में शुरू होता है, और विकास प्रक्रियाओं किशोर अवधि तक जन्म के बाद जारी है । तंत्रिका तंत्र के जन्मोत्तर परिपक्वता तंत्रिका सर्किट की सटीक synaptic तारों, जो6मस्तिष्क के शारीरिक और संज्ञानात्मक कार्यों के लिए आवश्यक है शामिल हैं । इसलिए, नवजात समय खिड़कियों में होने वाले विकास की घटनाओं का अध्ययन न केवल सामान्य तंत्रिका विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी neurodevelopmental और neuropsychiatric विकारों के रोगजनन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं7 ,8. हालांकि वयस्क कुतर के लिए stereotaxic ब्रेन सर्जरी के तरीके आसानी से उपलब्ध हैं2,9, कुछ प्रोटोकॉल नवजात चूहों में stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी के लिए इंटरनेट पर उपलब्ध हैं10,11. वास्तव में, नवजात माउस पिल्ले के दिमाग में रिएजेंट के stereotaxic microinjections मुश्किल है, क्योंकि नवजात पिल्ला के सिर भी मानक stereotaxic तंत्र में तय किया जा करने के लिए नाजुक है । फिर भी, ट्रांसजेनिक चूहों को stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी के आवेदन नवजात चूहों12के लिए व्यवहार्य है. यहां, हम नवजात माउस पिल्ले में stereotaxic मस्तिष्क सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए एक घर का सेटअप के साथ एक सरल विधि का वर्णन । हम प्रदर्शित करते है कि इस तकनीक को सशर्त एक microinjecting AAV द्वारा floxed जीन को हटाने के लिए रिपोर्टर जीन चूहों और सशर्त recombinase striatum चूहों के floxed में Cre डीएनए ट्रांसजेनिक व्यक्त की अनुमति देता है । यह तकनीक जंगली प्रकार के चूहों के नवजात striatum में रिएजेंट देने के लिए भी लागू है.
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन में, हम नवजात माउस दिमाग के striatum में AAV वायरस इंजेक्शन के लिए एक सरल और विश्वसनीय stereotaxic विधि प्रदर्शित करता है । हम P2 पर striatum रिपोर्टर चूहों के Ai14 में AAV-eGFP-Cre वायरस microinjected और फिर P14 पर रिपोर्टर जीन अभि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया अनुदान MOST104-2311-b-010-010-MY3, MOST106-2321-b-010-012, राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों अनुदान NHRI-EX106-10429NI, और विशेष रुप से प्रदर्शित क्षेत्रों अनुसंधान केंद्र कार्यक्रम अनुदान से मस्तिष्क अनुसंधान केंद्र, ताइवान में राष्ट्रीय यांग-मिंग विश्वविद्यालय के माध्यम से शिक्षा मंत्रालय, और Postdoctoral फैलोशिप अनुदान MOST106-2811-बी-010-031 (एस.-Y.C.), MOST105-2811-बी-010-036 और MOST106-2811-बी-010-030 (एच.-Y.K.) ।
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
Referências
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
