Método quantitativo e qualitativo para esfingomielina por LC-MS usando dois estável desvendar rotulado esfingomielina espécies
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar e qualificar cada espécie de esfingomielina usando múltiplas reação monitoramento e modo de MS/MS/MS, respectivamente.
Abstract
Apresentamos um método de analisar esfingomielina (SM) qualitativamente e quantitativamente por cromatografia líquida-electrospray espectrometria de massa de ionização-em tandem (LC-ESI-MS/MS). SM é um esfingolipídeos comum, composto por um phosphorylcholine e uma ceramida como o componente hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente. Um número de espécies de SM está presente em células de mamíferos devido a uma variedade da esfingoides longa cadeia de base (LCB) e um N-moiety de acila na ceramida. Neste relatório, vamos mostrar um método de estimar o número de carbono e ligações duplas em uma LCB e um N-grupo acila baseia seus íons de produto correspondente em experimentos de MS/MS/MS (MS3). Além disso, apresentamos um método de análise quantitativa para SM usando duas estável desvendar rotulado SM espécies, que facilita a determinação do intervalo utilizado na quantificação da SM. O presente método será útil em caracterizando uma variedade de espécies de SM em amostras biológicas e produtos industriais como cosméticos.
Introduction
Esfingomielina (SM) é um comum esfingolipídeos em células de mamíferos. SM é sintetizada intracelular1 e presente como um precursor para outros esfingolipídeos como um esfingosina-1-fosfato e uma ceramida, que têm papéis cruciais em imune celular tráfico e homeostase da barreira, respectivamente,2, a pele 3. Assim, a análise precisa do metabolismo SM é importante para elucidar as funções fisiológicas e patológicas de esfingolipídeos.
SM é composto por uma ceramida e um phosphorylcholine que está vinculada ao grupo da ceramida, composto por mais uma esfingosina e um N1-hidroxi-grupo acila. Uma variedade do número de carbono e uma ligação dupla na esfingosina e N-grupo acila resulta na espécie número de ceramida (e SM). Avanços recentes na LC-ESI-MS/MS permitiu uma análise quantitativa e qualitativa de SM4,5. Na análise qualitativa, o número de carbono e ligações duplas de um esfingoides LCB de SM foi identificadas atribuindo espectros de íon produto da LCB. No entanto, informações estruturais do N-grupo acila não foram obtida diretamente porque seus íons correspondentes do produto não foram relatados e, portanto, N-metades de acila foram deduzidas pela análise diferencial entre íons precursor e íons de produto correspondente a LCB em ambos os modos de iões positivos e negativos4,5. Neste relatório, nós apresentamos um método para detectar os íons de produto da LCB e N-moiety de acila simultaneamente em modo de3 MS usando triplo quadrupolo e espectrometria maciça linear ion trap quadrupolo, que facilita a precisão estrutural especulação de cada espécie de SM6.
Os efeitos de supressão (ou aprimoramento) do íon causados pela matriz em amostras biológicas dificultam a quantificação exata na análise de LC-ESI-MS, e portanto, é desejável para construir as curvas de calibração para todos os analitos de interesse na matriz idêntica da amostra biológica. No entanto, esta estratégia não é viável porque é quase impossível preparar todas as espécies de SM em amostras biológicas, especialmente em uma análise abrangente. Assim, é prático para construir uma curva de calibração e determinar a escala quantitativa usando uma espécie de SM representante cravada nas amostras biológicas. Usamos duas espécies de SM desvendar-etiquetados para construir uma curva de calibração; foi usada para um padrão interno e outro para um padrão composto. Detectamos uma pequena quantidade de espécies de SM desvendar-rotulado como um padrão composto cravado em amostras biológicas e obtido com êxito uma curva de calibração e a escala quantitativa6.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente método qualitativo, obtivemos MS3 íons de produto de um SPC e um N-grupo acila. É fundamental para atribuir adequadamente tanto um SPC e um N-grupo acila. Para este fim, note-se que outras moléculas contendo phosphorylcholine também podem ser detectadas como MS3 íons de produto. Diacil-fosfatidilcolina (PC) e plasmalogen-PC estão abundantemente presentes em células de mamíferos, e sua hidrofobicidade é similar de SM. Portanto, diacil-PC e PC-plasmalogen com um…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão (KAKENHI) para KH (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), KY (#26461532) e um subsídio para o estudo do projeto de doença intratável do Ministério da Saúde, trabalho e Previdência (K.Y. #201510032A). Agradecemos ao grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto deste manuscrito.
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
Referências
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