Kvantitative og kvalitative metode for Sphingomyelin af LC-MS bruger to stabile brændselsfremstilling mærket Sphingomyelin arter
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at kvantificere og kvalificere hver sphingomyelin arter ved hjælp af flere reaktion overvågning og MS/MS/MS tilstand, henholdsvis.
Abstract
Vi præsenterer en metode med at analysere sphingomyelin (SM) kvalitativt og kvantitativt ved liquid chromatography-electrospray Ionisation-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). SM er et fælles sphingolipid bestående af en phosphorylcholine og en ceramid som den hydrofile og hydrofobe komponent, henholdsvis. En række SM arter er til stede i pattedyrceller på grund af en række i den sphingoid lang kæde base (LCB) og et N-acyl gruppe i ceramid. I denne rapport, viser vi en metode til at anslå antallet af kulstof og dobbeltbindinger i en LCB og et N-acyl gruppe baseret på deres tilsvarende produkt ioner i MS/MS/MS (MS3) eksperimenter. Derudover præsenterer vi en kvantitativ analysemetode for SM ved hjælp af to stabile brændselsfremstilling navngivet SM arter, som letter fastsættelse af den anvendte i SM kvantitering måleområde. Den nuværende metode vil være nyttig i kendetegner en række SM arter i biologiske prøver og industrielle produkter som kosmetik.
Introduction
Sphingomyelin (SM) er en fælles sphingolipid i pattedyrsceller. SM er syntetiseret intracellulært1 og nutiden som en forløber for andre sphingolipids såsom en sphingosine-1-fosfat og en ceramid, som har afgørende roller i immune celle handel og hud barriere homøostase, henholdsvis2, 3. Således, den præcise analyse af SM stofskifte er vigtigt for belyse de fysiologiske og patologiske roller for sphingolipids.
SM er sammensat af en ceramid og et phosphorylcholine, der er knyttet til den 1-hydroxy gruppe af ceramid, som yderligere er sammensat af en sphingosine og en N-acyl gruppe. Et udvalg i carbon og dobbeltbinding tallene i både sphingosine og N-acyl gruppe resulterer i arternes antal ceramid (og SM). Seneste fremskridt inden for LC-ESI-MS/MS har aktiveret kvantitativ og kvalitativ analyse af SM4,5. I den kvalitative analyse, blev antallet af kulstof og dobbeltbindinger af en sphingoid LCB af SM identificeret ved at tildele produkt ion spektre af LCB. Imidlertid strukturelle oplysninger af N-acyl gruppe var ikke direkte fremstillede fordi dens tilsvarende produkt ioner ikke er blevet rapporteret, og derfor N-acyl fraspaltning blev udledt af differentieret analyse mellem forløber ioner og produkt ioner svarende til LCB i både positiv og negativ ion modus4,5. I denne betænkning, vi præsenterer en metode til at registrere produktet ioner af både LCB og N-acyl gruppe samtidig i MS3 tilstand ved hjælp af tredobbelt Quadrupol og Quadrupol lineær ion trap-massespektrometri, som letter den præcise struktur spekulationer af hver SM arter6.
Ion suppression (eller forbedring) effekter forårsaget af matrix i biologiske prøver hæmme nøjagtig kvantificering i LC-ESI-MS analyse, og det er derfor ønskeligt at konstruere kalibreringskurverne for alle analysander interesse i matrixen identiske den biologiske prøve. Denne strategi er imidlertid ikke muligt, fordi det er næsten umuligt at forberede alle SM arter i biologiske prøver, navnlig omfattende analyse. Således er det praktisk at konstruere en kalibreringskurve og bestemme kvantitative området ved hjælp af en repræsentativ SM arter spidse i de biologiske prøver. Vi brugte to brændselsfremstilling mærket SM arter for at konstruere en kalibreringskurve; en blev brugt til en intern standard og den anden for en standard sammensatte. Vi opdaget en lille mængde af brændselsfremstilling mærket SM arter som en standard sammensatte spidse i biologiske prøver og med succes opnået en kalibreringskurve og kvantitative række6.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den nuværende kvalitative metode, vi opnåede MS3 produkt ioner af en SPC og et N-acyl gruppe. Det er afgørende for korrekt tildele både en SPC og et N-acyl gruppe. Med henblik herpå, skal det bemærkes, at andre phosphorylcholine-holdige molekyler kan også påvises som MS3 produkt ioner. Diacyl-phosphatidylcholin (PC) og plasmalogen-PC er rigeligt til stede i pattedyrceller, og deres hydrophobicity er svarer til SM. Derfor kan diacyl-PC og plasmalogen-PC med en isotop (norm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af forskning tilskud fra Undervisningsministeriet, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan (KAKENHI) til K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), Ky (#26461532) og et tilskud til studiet af vanskelige sygdom projekt fra ministeriet for Sundhed, arbejdskraft og velfærd (Ky #201510032A). Vi takker gruppen Edanz (www.edanzediting.com/ac) til at redigere et udkast af dette manuskript.
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
Referências
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
