Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu quantifizieren und zu einzelnen Sphingomyelin Arten mit mehreren Reaktionskontrolle zu qualifizieren und MS/MS/MS-Modus, beziehungsweise.
Abstract
Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von Sphingomyelin (SM) qualitativ und quantitativ durch flüssige Chromatographie-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS). SM ist eine gemeinsame Sphingolipid bestehend aus einem phosphorylcholin und ein Ceramid als hydrophile und hydrophobe Komponente, beziehungsweise. Eine Reihe von SM-Arten sind in Säugerzellen aufgrund einer Vielzahl in der Sphingoid lange Kette base (LCB) und eine N-Acyl Glyko-in die Ceramid. In diesem Bericht zeigen wir eine Methode zur Schätzung der Zahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen in einem LCB und eine N-Acyl Glyko-basierend auf ihren entsprechenden Produkt-Ionen in MS/MS/MS (MS3) Experimente. Darüber hinaus präsentieren wir eine Quantitative Analyse-Methode für SM mit zwei stabilen isotopisch beschriftete SM Arten, die erleichtert die Bestimmung der Reichweite in SM Quantifizierung verwendet. Das vorliegende Verfahren werden bei der Charakterisierung der SM Artenvielfalt in biologischen Proben und industrielle Produkte wie Kosmetika.
Introduction
Sphingomyelin (SM) ist eine gemeinsame Sphingolipid in Säugetierzellen. SM ist synthetisiert intrazellulär1 und Gegenwart als Vorstufe für andere Sphingolipide wie ein Sphingosine-1-Phosphat und ein Ceramid, die entscheidende Rolle im Immunsystem haben-Handel Handy und Barriere Homöostase, bzw.2Haut, 3. Daher ist die genaue Analyse des Stoffwechsels SM wichtig für die Aufklärung der physiologischen und pathologischen Rollen der Sphingolipide.
SM besteht aus einem Ceramid und ein phosphorylcholin, die mit 1-hydroxy-Gruppe von der Ceramid weiter ein Sphingosine und ein Nbesteht-Acyl Glyko-. Eine Vielzahl der Kohlenstoff- und Doppelbindung in der Sphingosine und NZahlen-Acyl Glyko-ergibt sich die Anzahl der Ceramid (und SM) Arten. Jüngste Fortschritte in der LC-ESI-MS/MS ermöglichte die quantitative und qualitative Analyse der SM4,5. In der qualitativen Analyse wurde die Anzahl der Kohlenstoff und Doppelbindungen der ein Sphingoid LCB SM identifiziert, durch die Zuordnung von Produkt Ion Spektren des LCB. Jedoch Strukturinformation der N-Acyl Glyko-wurde nicht direkt erhalten, weil die entsprechenden Produkt-Ionen nicht gemeldet worden sind, und daher N-Acyl-Moieties wurden durch differenzierte Analyse zwischen Vorläufer Ionen abgeleitet und Produkt-Ionen entsprechend LCB in sowohl positive als auch negative Ionen-Modi4,5. In diesem Bericht präsentieren wir eine Methode zur Erkennung der Produkt-Ionen des LCB und N-Acyl Glyko-gleichzeitig in MS3 -Modus mit triple Quadrupol und Quadrupol lineare Ionenfalle Massenspektrometrie, die die genaue Struktur erleichtert Spekulationen über jedes SM-Arten-6.
Die Ionen-Unterdrückung (oder Erweiterung) Auswirkungen verursacht durch die Matrix in biologischen Proben behindern die genaue Quantifizierung in LC-ESI-MS-Analyse, und daher ist es wünschenswert, Kalibrierkurven für alle Analyten von Interesse in der identischen Matrix erstellen von der biologischen Probe. Diese Strategie ist jedoch nicht zumutbar, weil es fast unmöglich, alle Arten von SM in biologischen Proben, vor allem in der umfassenden Analyse vorzubereiten. So ist es praktisch, eine Kalibrierungskurve zu konstruieren und den quantitativen Bereich mit einer repräsentativen SM Art versetzt in den biologischen Proben zu bestimmen. Wir verwendet zwei isotopischer beschriftet SM-Arten, um eine Kalibrierungskurve zu konstruieren; einer war für einen internen Standard und die andere für eine Standard-Verbindung verwendet. Wir haben eine kleine Menge SM-Art isotopischer beschriftet als standard Verbindung versetzt in biologischen Proben und erfolgreich eine Kalibrationskurve und quantitativen Bereich6festgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dem vorliegenden qualitativen Verfahren, die wir erhalten, MS3 Produkt Ionen eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Es ist wichtig, richtig ordnen Sie eine SPC und ein N-Acyl Glyko-. Zu diesem Zweck sollte angemerkt werden, dass andere phosphorylcholin-haltige Moleküle auch als MS3 Produkt Ionen nachgewiesen werden können. Diacyl-Phosphatidylcholin (PC) und Plasmalogen-PC sind reichlich vorhanden in Säugetierzellen und ihre Hydrophobie ist ähnlich dem von SM. Daher können Diacyl-P…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Forschungsstipendium für das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan (KAKENHI), K.H (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y (#26461532) und ein Stipendium für das Studium der hartnäckigen Krankheit-Projekt vom Ministerium für Gesundheit, Arbeit und Wohlfahrt (K.Y #201510032A). Wir danken der Edanz Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
Referências
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