नियंत्रण रेखा से Sphingomyelin के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक विधि-MS दो स्थिर Isotopically लेबल Sphingomyelin प्रजातियों का उपयोग
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल को यों तो क्रमशः और कई प्रतिक्रिया निगरानी और एमएस/ms/ms मोड, का उपयोग कर प्रत्येक sphingomyelin प्रजातियों के योग्य वर्तमान ।
Abstract
हम sphingomyelin (SM) गुणात्मक और मात्रात्मक द्वारा तरल क्रोमैटोग्राफी-electrospray Ionization-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ईएसआई-ms/ms) का विश्लेषण करने की एक विधि प्रस्तुत करते हैं । SM एक phosphorylcholine और हाइड्रोफिलिक और hydrophobic घटक के रूप में एक ceramide से बना एक आम sphingolipid है, क्रमशः । sphingoid लांग चेन बेस (LCB) और moiety में एक N-acyl ceramide में कई प्रकार के कारण स्तनधारी कोशिकाओं में एसएम प्रजातियों के एक नंबर मौजूद हैं । इस रिपोर्ट में, हम एक LCB में कार्बन और दोहरे बांड की संख्या का आकलन करने की एक विधि दिखाते हैं और एक N-acyl moiety में उनके इसी उत्पाद आयनों के आधार पर ms/ms/ms (ms3) प्रयोगों में । इसके अतिरिक्त, हम sm प्रजातियों के लेबल वाले दो स्थिर isotopically का उपयोग करके sm के लिए एक मात्रात्मक विश्लेषण विधि प्रस्तुत करते हैं, जो sm quantitation में प्रयुक्त श्रेणी का निर्धारण करने की सुविधा देता है । वर्तमान पद्धति जैविक नमूनों और औद्योगिक उत्पादों जैसे सौंदर्य प्रसाधनों में एसएम प्रजातियों की एक किस्म निस्र्पक में उपयोगी होगी ।
Introduction
Sphingomyelin (SM) स्तनधारी कोशिकाओं में एक आम sphingolipid है । SM intracellularly1 संश्लेषित और एक sphingosine-1-फॉस्फेट और एक ceramide, जो प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी और त्वचा बाधा homeostasis, क्रमशः2में महत्वपूर्ण भूमिका है के रूप में अंय sphingolipids के लिए एक अग्रदूत के रूप में प्रस्तुत है, 3. इस प्रकार, एसएम चयापचय का सटीक विश्लेषण sphingolipids की शारीरिक और रोग भूमिकाओं elucidating के लिए महत्वपूर्ण है ।
एसएम एक ceramide और एक phosphorylcholine है कि ceramide के 1-hydroxy समूह से जुड़ा हुआ है, जो आगे एक sphingosine और एक N-acyl moiety से बना है से बना है । sphingosine और N-acyl moiety दोनों में कार्बन और दोहरे बांड संख्या में एक किस्म ceramide (और SM) प्रजातियों की संख्या में परिणाम है । LC-ईएसआई-ms/ms में हाल ही में अग्रिमों की मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण SM4,5के लिए सक्षम किया गया है । गुणात्मक विश्लेषण में, LCB के उत्पाद आयन स्पेक्ट्रा असाइन करके SM के एक sphingoid LCB के कार्बन और दोहरे बांड की संख्या की पहचान की गई । हालांकि, n-acyl moiety की संरचनात्मक जानकारी सीधे प्राप्त नहीं किया गया था क्योंकि इसके इसी उत्पाद आयनों की सूचना नहीं दी गई है, और इसलिए N-acyl moieties के प्रणेता आयनों के बीच विभेदक विश्लेषण द्वारा मुजे किया गया और उत्पाद आयनों दोनों सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड4,5में LCB करने के लिए इसी । इस रिपोर्ट में, हम दोनों LCB और N-acyl moiety के उत्पाद आयनों का पता लगाने के लिए एक विधि वर्तमान में एक साथ एमएस3 मोड का उपयोग ट्रिपल quadrupole और quadrupole रैखिक आयन जाल जन स्पेक्ट्रोमेट्री, जो सटीक संरचनात्मक सुविधा प्रत्येक SM प्रजातियों की अटकलें6।
आयन दमन (या वृद्धि) जैविक नमूनों में मैट्रिक्स की वजह से प्रभाव नियंत्रण रेखा में सटीक ठहराव-ईएसआई-एमएस विश्लेषण में बाधा, और इसलिए, यह समान मैट्रिक्स में ब्याज की सभी analytes के लिए अंशांकन curves का निर्माण करने के लिए वांछनीय है जैविक नमूना है । हालांकि, इस रणनीति संभव नहीं है क्योंकि यह जैविक नमूनों में सभी एसएम प्रजातियों, विशेष रूप से व्यापक विश्लेषण में तैयार करने के लिए लगभग असंभव है । इस प्रकार, यह एक अंशांकन वक्र का निर्माण करने के लिए व्यावहारिक है और जैविक नमूनों में नुकीला एक प्रतिनिधि एसएम प्रजातियों का उपयोग मात्रात्मक श्रृंखला का निर्धारण । हम एक अंशांकन वक्र का निर्माण करने के लिए दो isotopically-लेबल एसएम प्रजातियों का इस्तेमाल किया; एक एक मानक यौगिक के लिए एक आंतरिक मानक और दूसरे के लिए इस्तेमाल किया गया था । हम isotopically की एक छोटी राशि का पता लगाया-लेबल SM प्रजातियों के रूप में एक मानक यौगिक जैविक नमूनों में नुकीला और सफलतापूर्वक एक अंशांकन वक्र और मात्रात्मक श्रेणी6प्राप्त ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान गुणात्मक विधि में, हम एक SPC और एक एन-acyl moiety के एमएस3 उत्पाद आयनों प्राप्त की । यह ठीक से दोनों एक SPC और एक N-acyl moiety असाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह अंत करने के लिए, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और जापान के प्रौद्योगिकी (KAKENHI) को K.H. (#15K01691), Y.F. (#15K08625), K.Y. (#26461532), और मंत्रालय से असभ्य रोग परियोजना के अध्ययन के लिए अनुदान के मंत्रालय से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया स्वास्थ्य, श्रम और कल् याण (K.Y. #201510032A) । हम इस पांडुलिपि का एक मसौदा संपादन के लिए Edanz समूह (www.edanzediting.com/ac) का शुक्र है ।
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
Referências
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