Kvantitativ och kvalitativ metod för ceramidas av LC-MS med två stabila Isotopically märkt ceramidas arter
Summary
Här presenterar vi ett protokoll att kvantifiera och kvalificera varje ceramidas Art använder flera reaktionsövervakning och MS/MS/MS läge, respektive.
Abstract
Vi presenterar en metod för att analysera ceramidas (SM) kvalitativt och kvantitativt av liquid chromatography-elektrospray jonisering-tandem masspektrometri (LC-ESI-MS/MS). SM är en gemensam sphingolipid som består av en fosforylkolin och en ceramide som komponenten hydrofil och hydrofoba, respektive. Ett antal SM arter förekommer i däggdjursceller på grund av en mängd i sphingoid långa kedjan bas (LCB) och en N-acyl biexponentiellt i ceramide. I den här rapporten visar vi en metod för att uppskatta antalet kol och dubbelbindningar i en LCB och en N-acyl biexponentiellt baserat på deras motsvarande produkt joner i MS/MS/MS (MS3) experiment. Dessutom presenterar vi en kvantitativ analysmetod för SM med två stabila isotopically märkt SM arter, vilket underlättar att bestämma intervallet används i SM kvantifieringsmetoden. Denna metod kommer att vara användbart i karaktärisera en mängd SM arter i biologiska prover och industriprodukter såsom kosmetika.
Introduction
Ceramidas (SM) är en gemensam sphingolipid i däggdjursceller. SM är syntetiseras intracellulärt1 och närvarande som en föregångare för andra Sfingolipider såsom en sfingosin-1-fosfat och en ceramide, som har avgörande roller i immunförsvaret cell människohandel och hudens barriär homeostas, respektive2, 3. En exakt analys av SM metabolismen är därför viktigt för belysa Sfingolipider fysiologiska och patologiska roller.
SM består av en ceramide och en fosforylkolin som är kopplad till den ceramide, som ytterligare består av en sfingosin och en N1-hydroxy grupp-acyl biexponentiellt. En mängd i kol och dubbelbindningen siffrorna i både sfingosin och N-acyl biexponentiellt resulterar i antal ceramide (och SM) arter. Senaste framstegen inom LC-ESI-MS/MS har aktiverat kvantitativ och kvalitativ analys av SM4,5. I den kvalitativa analysen identifierades antalet kol och dubbelbindningar i en sphingoid LCB av SM genom att tilldela produkt ion spektra av LCB. Dock strukturell information av N-acyl biexponentiellt erhölls inte direkt eftersom dess motsvarande produkt joner inte har rapporterats, och därför N-acyl beståndsdelarna var utläsas av differentierad analys mellan föregångare joner och produkten joner motsvarar LCB i både positiva och negativa jonen lägen4,5. I denna rapport presenterar vi en metod för att identifiera produkten jonerna av både LCB och N-acyl biexponentiellt samtidigt i MS3 läge använder trippel quadrupole och quadrupole linjär ion trap-masspektrometri, vilket underlättar den exakta strukturellt spekulation av varje SM arter6.
De ion suppression (eller förbättring) effekter som orsakas av matrisen i biologiska prover hindrar korrekt kvantifiering i LC-ESI-MS analys, och det är därför önskvärt att konstruera kalibreringskurvor för alla analyter i matrisen identisk av det biologiska provet. Denna strategi är dock inte möjligt eftersom det är nästan omöjligt att förbereda alla SM arter i biologiska prover, särskilt i omfattande analys. Därför är det praktiskt att konstruera en kalibreringskurva och fastställa kvantitativa använder en representativ SM Art spetsade i biologiska prover. Vi använde två isotopically-märkt SM arter för att konstruera en kalibreringskurva; en användes för intern standard och den andra för en standard som är sammansatta. Vi har upptäckt en liten mängd isotopically-märkt SM arter som en standard förening spetsade i biologiska prover och framgångsrikt fått en kalibreringskurva och de kvantitativa sortiment6.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna kvalitativa metod, vi fått MS3 produkt joner av ett Tilläggsskydd och en N-acyl biexponentiellt. Det är viktigt att korrekt tilldela både ett Tilläggsskydd och en N-acyl biexponentiellt. I detta syfte bör det noteras att andra fosforylkolin-innehållande molekyler kan också identifieras som MS3 produkt joner. Diacyl-fosfatidylkolin (PC) och plasmalogen-PC finns rikligt i däggdjursceller, och deras vattenavvisande egenskaper är liknande den i SM. Därför kan diacyl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ett forskningsanslag från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik av Japan (KAKENHI) att K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) och bidrag för studier av svårbehandlad sjukdom projekt från ministeriet för Hälsa, arbete och välfärd (K.Y. #201510032A). Vi tackar gruppen Edanz (www.edanzediting.com/ac) för att redigera ett utkast till detta manuskript.
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
Referências
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
