Summary
Målet med denne protokol er at påvise den intra-prostata injektion af prostata cancerceller, med efterfølgende kastration. Orthotopic prækliniske modeller af androgen-afhængige og kastration-resistente prostatakræft er kritisk at studere sygdomme i forbindelse med en klinisk relevant tumor mikromiljø og en immunkompetente vært.
Abstract
Orthotopic tumor modellering er et værdifuldt værktøj til præ-klinisk prostatakræft forskning, som det har flere fordele i forhold til både subkutane og transgene genetisk manipuleret musemodeller. I modsætning til subkutan tumorer indeholde orthotopic tumorer mere klinisk nøjagtig Vaskulaturen, tumor mikromiljø og svar til flere behandlinger. I modsætning til genetisk modificerede musemodeller, orthotopic modeller kan udføres med lavere omkostninger og i mindre tid, indebærer brug af meget kompleks og heterogen mus eller menneskelige cancer cellelinjer, snarere at enkelt genetiske ændringer, og disse celle linjer kan være genetisk modificerede, såsom at udtrykke imaging agenter. Vi præsenterer her, en protokol til kirurgisk indsprøjte en luciferase - og mCherry-udtrykker murine prostata cancer cellelinie i de anteriore prostata lap af mus. Disse mus udviklet orthotopic tumorer, der var ikke-invasivt overvåget i vivo og yderligere analyseret for tumor volumen, vægt, mus overlevelse og immun infiltration. Orthotopic tumor-bærende mus blev yderligere, kirurgisk kastreret, fører til øjeblikkelig tumorregression og efterfølgende fornyet, der repræsenterer kastration-resistente prostatakræft. Selv om teknisk dygtighed er forpligtet til at udføre denne procedure, er denne syngeneic orthotopic model af både androgen-afhængige og kastration-resistente prostatakræft til stor gavn for alle efterforskere i feltet.
Introduction
Prostatakræft er anslået til at have den højeste forekomst (161,360 mænd) og forårsage tredje-mest mandlige kræftdødsfald (84,590 mænd) i 20171. Efter diagnose, prostata tumorer er androgen-afhængige, og behandles ved kirurgisk prostatektomi, strålebehandling og/eller androgen berøvelse terapi (ADT), men hver behandling er forbundet med flere større morbiditet og komplikationer2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. trods tumorregression efter ADT, næsten alle tumorer gentages som kastration-resistente prostatakræft (CRPC). På dette stadium, godkendte behandlinger omfatter docetaxel, Sipuleucel-T immunterapi, og anti-androgen små molekyler enzalutamide og abiraterone endnu ingen individuel terapi giver en overlevelse fordel af mere end 5,2 måneder11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. derfor, mænd i alle faser af prostatakræft skal både forbedrede behandlingsmuligheder og forvaltning af morbiditet, modellering er afgørende for hvilke optimal prækliniske sygdom.
Med korrekt procedure, kan prostata cancer cellelinjer være kirurgisk Instilleres i murine prostata, fører til udviklingen af begge syngeneic eller xenogene orthotopic tumorer. Orthotopic tumor modellering er ideel til alle tumor biologi og medicin Udviklingsforskning, giver mulighed for tumor udvikling med en klinisk repræsentative tumor mikromiljø (TME). Tidligere undersøgelser har vist, at subkutant (s.c.) tumorer har en ændret tumor Vaskulaturen, fører til differentieret og mindre klinisk nøjagtige svar til anti-angiogene terapier18,19. Derudover har flere undersøgelser observeret øget eller nedsat virkning af flere kemoterapeutika til behandling af de samme cellelinje, afhængigt af om det var administreres s.c. eller orthotopically, hvor sidstnævnte bedst repræsenteret hvad er set i menneskets kræft20,21,22. Yderligere, kun i en orthotopic model for tyktarmskræft, men ikke i modellen s.c., tumorer producere de korrekte degradative enzymer nødvendig for at fremkalde metastase23. Endelig, som immunoterapi fortsætter med at komme på forkant med kræftbehandling, og især da de skulle give væsentlig gavn for prostatakræft24,25, syngeneic prækliniske modeller med nøjagtige TME endnu og dræning lymfeknuder i immunkompetente værter er kritisk.
Der er mange faktorer ansvarlig for disse inkonsistente resultater baseret på tumor site. Med en forskellige TME, kræftceller er udsat for forskellige væv-specifikke endothelium og ændret angiogenese, derved påvirker tumor udvikling26,27. Orthotopic tumorer med den korrekte TME mulighed for klinisk relevante medicinafgivelse, hypoksiske betingelser og evaluering af anti-angiogene terapier28. Mens gensplejsede modeller (ædelstene) indeholder en nøjagtig TME, de kræver lange gange til avl, høje omkostninger og er ofte baseret på manipulationer af enkelt eller få gener slået ud eller overexpressed ud over klinisk relevante niveauer. Menneskelige eller murine prostata cancer cellelinjer bruges i orthotopic tumorer, ligesom humane tumorer, er derimod langt mere genetisk komplekse både i enkelte celler og vise heterogenitet mellem celler29,30. Også i modsætning til perler, orthotopic kræft cellelinjer kan være udviklet til at give udtryk for billeddiagnostiske modaliteter eller øget eller nedsat niveau af andre molekyler af interesse, og i in vitro og i vivo eksperimentelle resultater kan sammenlignes direkte. Orthotopic tumorer kan også dannes fra primære patient-afledte celler. Her rapporterer vi metoden for at udføre intra-prostata injektioner af prostata cancerceller, der danner orthotopic androgen-afhængige tumorer, og efter kastration, gentages som orthotopic CRPC.
Protocol
Alle dyr procedurer skitseret i denne protokol der skal udføres i overensstemmelse med etiske regler og godkendelse af passende universitetet institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC).
1. forberedelse af kirurgisk materialer og kræftceller
- Før dag, kirurgi, autoklave af mikro-dissekere saks, Graefe pincet, Graefe væv pincet, nålen holder med sutur kuttere, og det relevante antal gardiner. Sterilisere et 50 µL sprøjte og 28-gauge nåle af ethylen oxid gas (figur 1 c).
- Forud for kirurgi, kultur Myc-CaP celler i 10 cm retter i RPMI suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin (P/S) i et 37 ° C 5% CO2 inkubator. For en bioluminescerende og/eller fluorescerende tumor overvågning, transfect 293T celler med de passende vektorer og efterfølgende transduce Myc-CaP celler med 0,45 µm filtreret lentivirus31. Sortere cellerne til at generere en stabil cellelinie med 100% transduktion positivitet.
Bemærk: Udfører alle vævskultur under sterile forhold, og kontrollere, at alle cellelinjer mycoplasma-fri. Murine prostata cancer cellelinie udnyttet i dette studie, Myc-CaP32, er transduced stabilt udtrykke både firefly luciferase og mCherry. Myc-CaP celle linje iss isoleret fra en c-myc-overekspression Hi-myc mus, og disse celler indeholder en forstærket androgen receptor (AR), som er androgen-afhængige32 og danne CRPC tumorer efter murine kastration33. Alle musene i dette studie er 6-8 uge gamle mandlige FVB/NJ mus. Alternative murine prostata cancer cellelinjer kan bruges med mus af relevante genetiske baggrund, samt menneskelig prostata cancer cellelinjer eller primære patient-afledte prostata cancerceller med immundefekte mus. Det optimale antal celler pr. injektion bør fastsættes empirisk for alternative cellelinjer. Derudover kan alternativ imaging modaliteter udnyttes til at visualisere tumorer, herunder magnetisk resonans imaging (MR), positron emissions tomografi (PET) og computertomografi (CT), og normal god landbrugspraksis som et alternativ til mCherry. - Aftenen før kirurgi, placere matrigel basalmembranen matrix og phenol rød-fri på isen ved 4 ° C til at tø.
- På dagen for operationen, skal du indsamle cellerne ved at vaske dem med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og afmontering med 0,25% trypsin-EDTA. Neutralisere trypsin med RPMI med 10% FBS og 1% P/S.
- Der centrifugeres celler ved 400 x g i 5 min.
- Cellerne vaskes med 10 mL af RPMI uden FBS eller P/S.
- Tælle cellerne og resuspend celler i PBS ved en koncentration på 6.67x107 celler/mL (1 × 106 celler/15 µL).
- Tilføje et lige saa stort volumen af matrigel til at oprette en 1:1 PBS/matrigel cellesuspension i en endelig koncentration på 1 × 106 celler/30 µL, og holde celler på is indtil injektion til at forhindre størkning.
Bemærk: Udføre intra-prostata injektioner inden for 3 timer til at forberede matrigel celle suspensioner. Hvis udfører intra-prostata injektioner på mere end 5 mus, skal du gentage trinene ovenfor for at forberede en frisk matrigel cellesuspension.
2. præ-operativ mus forberedelse
Bemærk: hus mus i Universitet dyr facilitet for mindst en uge før operation at give mulighed for tilstrækkelig tilpasning og minimere dyrenes stress. Trin 2.1-2.6 er udført af kirurgen assistent. Alle efterfølgende kirurgiske trin udføres af kirurgen bruger sterile handsker og kirurgiske værktøjer med steril teknik.
- Bedøver mus med isofluran (2-5% for induktion via kammer, 1-3% for vedligeholdelse via næsen kegle). Kontrollere fuld induktion af tabet af tå knivspids refleks.
- Vejer mus og administrere mindst 0,05 mg/kg af det smertestillende buprenorphin s.c.
Bemærk: Musen vægt ≥20 g er ideel til vellykket intra-prostata injektioner. - Anvende oftalmologiske salve smøring på begge øjne til at forhindre hornhinde tørring.
- Barbere alle skind fra maven.
- Sterilisere maven af tre runder af cirkulære anvendelse af kirurgisk krat ved hjælp af steril ikke at overholde puder efterfulgt af sterile alkohol klude. Give maven til at tørre.
Bemærk: For resten af den kirurgiske procedure er kun sterile handsker og kirurgiske instrumenter kan kontakte steriliseret mus maven. - Overføre musen liggende på en ren overflade på en varmepude direkte under målet om en ren kirurgisk mikroskop.
- Dække mus med en steril drapere med et lille hul skåret over maven.
3. Intra-prostata injektion
Bemærk: Udfør alle kirurgiske skridt under sterile forhold. Justering af mikroskopet, mus placering, eller nogen skal andre ikke-sterile objekter gøres ved kirurg assistent.
- Udføre en ca 1 cm indsnit i den ydre hud langs midterlinjen af maven overlegen i forhold til penis og de preputial kirtler (fig. 1 d).
- Adskille bindevæv mellem den ydre abdominal hud og indre mave muskulaturen ved at åbne saks mellem lagene.
- Udføre en lignende snit af indre mave muskulaturen under brug af pincet til at hæve muskulatur for at undgå punktering tarm eller blære (fig. 1 d).
- Finde en af de bilaterale Sædblærer (figur 1A, hvid) / forreste prostata lapper (figur 1A, sort), som ofte posterior, laterale og lidt overlegne til blæren (figur 1A, gul), men dette kan variere mellem mus . De forreste prostata fliger er gennemskinnelig og knyttet til den mindre krumning af de hvide Sædblærer.
- Forsigtigt hæve spidsen af sædblæren bruger Graefe væv pincet til at skabe spænding på væv uden punktering sædblæren (figur 1E).
- Bland Myc-CaP matrigel løsning af hedenske pipettering (udført af kirurgen assistent), som cellerne kan have pelleted, og langsomt Aspirér 30 µL (1 x 106 celler) til nål til at undgå luftbobler.
- Omhyggeligt indsætte facet af nålen parallelt med den forreste prostata lap længdeakse. Tilføre lap 30 µL langsomt og langsomt trække nålen for at forhindre lækage (figur 1F). Kontrollere passende injektion af overfyldning af den forreste prostata lap (figur 1 g).
- Omhyggeligt holde sædblæren og injiceres prostata lap uden for musen til ca 30 s til at tillade matrigel delvist størkne inden lap. I løbet af denne tid, indsamle enhver celle løsning lækage i maven ved hjælp af en steril polyester spids applikator til at forhindre ikke-orthotopic tumor udvikling, uden at trykke på den injicerede prostata lap.
- Omhyggeligt returnere sædblæren og injiceres prostata lap i maven uden at lægge pres på lap. Erstatte enhver externalized væv.
- Udføre løbende sutur for at lukke den indre mave muskulatur med 5-0 vicryl resorberbare omvendt skære nål suturer.
- Udføre afbrudt sutur for at lukke de ydre abdominal hud med 4-0 nylon monofilamenter ikke-resorberbare omvendt skære nål suturer.
Bemærk: Steriliseret 9 mm hæfteklammer kan også bruges til at lukke de ydre abdominal hud. Men i modsætning til suturer, de forstyrrer alle efterfølgende en bioluminescerende og fluorescerende tumor imaging signal. - Rengør alle værktøjer med steril ethanol klude (åbnet af kirurgen assistent) og placere dem i et glas perle sterilizer for 30 s. Tillad værktøjer tørre inden anvendelse på den næste mus.
- Skyl sprøjte og kanyle i sterilt saltvand (åbnet af kirurgen assistent) for at forhindre tilstopning af rest matrigel.
Bemærk: En kirurg assistent bør være til stede ved alle operationer, udfører alle ikke-sterile præoperativ mus forberedelse og postoperativ mus pleje, samt at blande Myc-CaP matrigel løsning før injektioner. For at minimere tid, som hver intra-prostata mus procedure kræver 20-30 min, kan kirurgen assistent begynde at forberede den næste mus som kirurgen suturering den nuværende mus.
4. postoperative mus pleje
- Administrere 1 mg/kg af det smertestillende meloxicam s.c. straks, 24 h og 48 timer efter operationen.
- Tillad mus til at inddrive i et bur med ingen sengetøj placeret halvvejs på en varmepude. Overvåge mus i mindst 30 min efter operationen, indtil de genvinde normale mobilitet og aktivitet, efter hvilket placerer dem i en ren bur med mad på gulvet i buret.
- Yderligere at overvåge mus dagligt for ordentlig sårheling, kropsvægt, grooming og ambulation efter operationen. Separat mus til individuelle bure på eventuelle beviser af kampene.
- Fjerne eventuelle resterende suturer inden for 14 dage efter operationen.
5. en bioluminescerende Tumor Imaging
- Forberede steril-filtreret Na+ eller K+ D-luciferin, som beskrevet af fabrikanten og beskyttet mod lys.
- Injicere mus intra-peritoneally med 10 µL/g kropsvægt af luciferin.
- Mindst 10 min senere, billede mus med en IVIS spektrum Imaging System, som tidligere beskrevet34,35.
- Analysere billeder ved hjælp af levende billede Software, som tidligere beskrevet34,35.
Bemærk: IVIS imaging analyse er nyttige til at bestemme vellykket intra-prostata injektioner og oprindelige tumor udvikling til at normalisere tumor byrde blandt eksperimentelle grupper. Imidlertid afhængigt af intensiteten af en bioluminescerende eller fluorescerende signal, kan mætning forårsage et plateau i billedet kvantificering trods en stigning i faktiske tumorstørrelse. Derfor, i de senere stadier af tumorvækst, IVIS imaging kan være mere nyttigt at bestemme falder i tumorstørrelse ved vellykket behandling og ikke stigninger i størrelse efter billede mætning.
6. tumor indsamling, Tumor analyse, overlevelse slutpunkt
- Hvis indsamling tumor til analyse, humant euthanize mus ved CO2 eksponering og sekundære cervikal dislokation, eller alternative IACUC godkendte metoder, og dissekere tumorer fra underlivet. Tumorer bør være placeret orthotopically på prostata.
Bemærk: Tumorer fastgjort til den forreste bugvæggen eller seedede i hele underlivet indikerer dårlig eller utæt intra-prostata injektion, og bør ikke anses for orthotopic tumorer. - Veje tumorer.
- Beregning af tumor volumen som π/6 × L × W × H (L = længden af den længste akse af tumor, W = vinkelret bredde, H = vinkelret højde).
- Tumorer kan analyseres ved histologi (fix i 10% neutrale bufferet formalin), flow flowcytometri (oprette enkelt celle suspensioner), protein (forberede væv lysate i RIPA buffer), eller RNA (straks sted væv i RNAlater).
- For immunologiske analyse, også indsamle prostata tumor-afløb para-aorta lymfeknuder (figur 1B, orange) og milten.
Bemærk: Hvis efter mus for overlevelse, slutpunktet i denne model er defineret som udseendet af hæmoragisk abdominal ascites36 og/eller faldt ambulation, grooming, og/eller piloerection37. Mus overlevelse analyse modtage præ- og postoperativ analgesi (protokol trin 2.2, 4.1) og skal overvåges regelmæssigt. Mus bør opdeles i individuelle bure, hvis nogen kæmper opstår, og bør aflives humant, udseende af nogen af de ovenstående slutpunkt udlæsninger.
7. kirurgisk kastration model CRPC
- Til model CRPC, udføre ovenstående intra-prostata injektion protocol (protokol trin 1-5).
- Mindst en uge senere, efter tumor udvikling, udføre kirurgisk kastration via ætsninger, som tidligere beskrevet38.
- Overvåge tumorregression og gentagelse af en bioluminescerende billeddannelse. Tumorregression vil finde sted senest 3 dage efter kastration, og tumor recidiv vil forekomme i ca. 30 dage, der repræsenterer CRPC.
Representative Results
I dette manuskript injiceres vi kirurgisk murine prostata cancer cellelinie, Myc-CaP, ind i den forreste prostata lap (figur 1A), fører til udviklingen af orthotopic prostata tumorer med en klinisk relevant TME og korrekt prostata-afløb lymfeknuder (figur 1B). Dette blev udført ved hjælp af mikro-dissekere saks, Graefe pincet, Graefe væv pincet, en nål holder med sutur kuttere, og en 50 µL sprøjte med en 28-gauge kanyle (figur 1 c). Efter udførelse af en ca. 1 cm midterlinjen abdominal snit over de preputial kirtler (fig. 1 d), en sædblæren og vedlagte forreste prostata lap var placeret og externalized (figur 1E) og 30 µL (1 x 106 celler) af en 1:1 PBS/matrigel cellesuspension blev sprøjtet ind i prostata (figur 1F), som i første omgang bekræftet af overfyldning af lap og manglen på lækage (figur 1 g).
For at overvåge orthotopic tumorvækst, transfekteret vi stabilt Myc-CaP celler for at udtrykke både firefly luciferase og mCherry, giver mulighed for svulster skal følges af non-invasiv i vivo bioluminescens (figur 2A) og fluorescens (figur 2b), henholdsvis. En begrænsning af denne billeddannelse er, at, afhængigt af styrken af signalet, imaging kvantificering kan mætte mens tumoren fortsætter med at stige i størrelse. Derfor, med højt signal intensiteter, denne i vivo billeddannelse er mere nyttigt for i første omgang normalisere tumor byrde på tværs af eksperimentelle grupper og for senere falder i tumorstørrelse efter eksperimentelle behandlinger. Yderligere billeddiagnostiske modaliteter kan også udnyttes, som små dyr Mr, PET eller CT.
Orthotopic tumorer var dissekeret fra underlivet dag 30 efter intra-prostata injektion (figur 3A). Orthotopic tumorer bør være placeret på stedet, hvor den forreste prostata lap. Tumor masse i hele underlivet eller fastgjort til den forreste bugvæggen indikere forkert intra-prostata injektion og lækage. Med korrekt teknik, kan tumor volumen (figur 3B) og vægt (figur 3 c) registreres med relativt små standardfejl. Men som bemærket, der vil være nogle variation med små og store tumor masserne. Første brug af forbehandling imaging kvantificering at udligne tumor byrde mellem eksperimentelle våben er derfor afgørende for alle eksperimenter. Yderligere, da disse murine kræftceller blev injiceret i immunkompetente FVB/NJ mus, TME kan analyseres ved Immunohistokemi (IHC) (eller flowcytometri eller andre teknikker) for CD3 T celler (figur 3D) (eller andre immune celletyper). Endelig, denne model giver en objektiv overlevelse slutpunkt, som de store primære tumor masse årsager blødende abdominal ascites36 (figur 3) og/eller faldt ambulation, grooming, og/eller piloerection37. Lejlighedsvis, kan død også være forårsaget af tumorvækst blokering urinproduktion.
Endelig, denne model kan udnyttes til at studere både androgen-afhængige prostatakræft og CRPC, hvor sidstnævnte giver dårlig prognose og har brug for nye behandlingsmuligheder. Efter orthotopic tumor udvikling, var mus kirurgisk kastreret, som tidligere beskrevet38. Da dette er den anden store overlevelse kirurgi, skal ekstra pleje gives til at overvåge for nyttiggørelse og nogen bivirkninger eller komplikationer. Senest 3 dage efter kastration, var stærk tumorregression observeret, efterfulgt af efterfølgende tumor recidiv efter ca. 30 dage, der repræsenterer CRPC (figur 4A). CRPC tumorer kan være dissektion og analyseret Histologisk, og vise ikke nogen neuroendokrine differentiering, da de opretholde høje AR og er negative for den neuroendokrine markør, synaptophysin (figur 4B).
Figur 1: forreste prostata lap, dræning lymfeknuder og repræsentative teknik for intra-prostata celle injektioner. Billeder af (A) højre forreste prostata lap (sort, *), vedlagt rigtige sædblæren (hvid), højre testikel og fedt pad (grøn) og blære (gul), (B) bilaterale prostata-afløb para-aorta lymfeknuder (orange), (C) mikro-dissekere saks, Graefe pincet, Graefe væv pincet, en nål holder med sutur kuttere, og 50 µL sprøjte med 28-gauge kanyle (fra venstre til højre), (D) midterlinjen indsnit, (E) sædblæren og anterior prostata lap udlægning, (F), intra-prostata injektion og (G) overfyldning af den forreste prostata lap. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: In vivo en bioluminescerende og fluorescerende tumor imaging. (A) Luciferase- og (B) mCherry-udtrykker orthotopic Myc-CaP tumorer blev afbildet ved hjælp af en IVIS spektrum Imaging System. Bioluminescens var kvantificeres ved samlede flux (fotoner/s). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Orthotopic tumor analyser af tumor volumen, vægt, histologi for immun infiltration og overlevelse. Orthotopic tumorer blev dissekeret på dag 30 efter intra-prostata injektion og analyseret af (A) brutto imaging, (B) tumor volumen (π/6 × L × W × H; L = længden af den længste akse af tumor, W = vinkelret bredde, H = vinkelret højde), (C) tumor vægt, (D) CD3 IHC (skalalinjen = 100 µm), og (E) overlevelse, med den objektive slutpunkt som udseende hæmoragisk abdominal ascites. (A-B) Data, der repræsenteres som gennemsnit ± standard fejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Intra-prostata injektioner med efterfølgende kirurgisk kastration model både androgen-afhængige prostatakræft og CRPC. (A) mus forsynet med orthotopic luciferase-udtrykker tumorer blev afbildet af bioluminescens før og efter kastration (Cx), og (B) gentaget sig CRPC tumorer var dissekeret (sort = orthotopic prostata tumor, gul = blære) og analyseres af H & E, AR IHC, og synaptophysin IHC (med positiv murine kontrol) (skalalinjen = 50 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
I dette manuskript skitsere vi protokol for at udføre kirurgisk intra-prostata kræft celle injektioner. Vi udnyttede androgen-afhængige og MYC -overekspression (MYC overekspression er set op til 80-90% af menneskers prostatakræft39) murine prostata cancer cellelinie, Myc-CaP, oprindeligt isoleret fra Hi-Myc mus32 ,33. Denne cellelinje var stabilt transduced for at udtrykke både luciferase og mCherry, for ikke-invasiv i vivo en bioluminescerende og fluorescerende tumor imaging, henholdsvis. Yderligere, kirurgisk kastration blev også udført efter androgen-afhængige tumor udvikling, hvilket fører til tumorregression og efterfølgende gentagelser. Derfor, vi give oplysninger til model orthotopic androgen-afhængige prostatakræft og CRPC i en immunkompetente vært.
MYC-CaP celler blev injiceret ind i den forreste prostata lap af mus. Musen prostata består af de forreste, ventrale og dorsolateral prostata lapper og menneskelig prostata består af en yderzone, overgangszone og centrale zone inden for en enkelt lap40. Mens forudgående undersøgelser har anatomisk og histologisk sammenlignet dorsolateral mus lap til de menneskelige perifere zone, stedet, hvor størstedelen af prostata kræft41, og den forreste mus lap til menneskets centrale zone42, 43, mere nylige og omfattende analyse har vist, at den forreste lap og dorsolateral lap vise nært beslægtet gen expression mønstre, i forhold til den ventrale lap. 44 yderligere, prostatakræft udvikling er blevet observeret i de forreste lap af perler40og for den intra-prostata procedure, den anteriore lap giver mulighed for injektion af den nødvendige mængde af kræft celle løsning med minimal lækage og variation.
Ved hjælp af s.c. og transgene perle kræftmodeller har flere mangler og begrænsninger. S.c. tumorer dyrkes i en kunstig TME har differentieret svar til kemoterapier, i modsætning til begge orthotopic tumorer fra samme cellelinjer og menneskelig sygdom20,21,22. Dette kan skyldes den ændrede Vaskulaturen af s.c. tumorer, som eksemplificeret af deres differentieret svar til anti-angiogene terapi18,19. Tværtimod, orthotopic tumorer udvikle med en ordentlig TME, vaskulatur og afdrypning lymfeknuder, og kan udføres med murine cellelinjer, hvilket også giver mulighed for analyse af tumor immunologi og svar på immunoterapi.
Transgene perler udvikler tumorer med en ordentlig TME i en immunkompetente vært, men disse modeller typisk fremstille menneskelige kræft ved at udvikle tumorer med enkelt eller få genetiske ændringer29. En analyse af Myc-CaP og andre prostata cancer cellelinjer afslørede, at de indeholdt meget større somatiske kopi nummer ombygninger og kromosomale ændringer end tumorer fra Hi-Myc mus og andre ædelstene, hvorfra de var afledte29. Yderligere, perler er begrænset af de øgede omkostninger og tid for mus avl for at udføre eksperimenter af tilstrækkelig strøm. Orthotopic tumor modellering kan overvinde disse begrænsninger. Menneskelige og murine prostata cancer cellelinjer indeholder mange genetiske ændringer, der er relevante for menneskers sygdom29, og som menneskelige kræft, viser også stor heterogenitet mellem individuelle celler30. Orthotopic murine syngeneic tumorer mulighed for immunologiske analyser, samtidig med at orthotopic menneskelige xenogene tumorer mulighed for analyser af therapeutics på menneskelige celler. Endelig, i modsætning til med perler, celle linjer kan redigeres, før injektion, giver udtryk for en bioluminescerende eller fluorescerende imaging molekyler til at overvåge tumorvækst, normalisere tumor byrde blandt eksperimentelle grupper, overvåge svar til behandling, og at Følg tumorregression og CRPC tilbagefald efter kirurgisk kastration.
Kritiske trin i denne protokol omfatter lokalisering og externalizing sædblæren og vedlagte forreste prostata lap uden at beskadige andre væv eller punktering sædblæren, udføre en vellykket intra-prostata injektion af celle 30 µL suspension uden lækage, og ordentligt indsamle enhver lækage for at forhindre ikke-orthotopic tumor udvikling i hele underlivet. De store begrænsning af intra-prostata injektioner er at nå de tekniske færdigheder kræves for at minimere tumor variabiliteten mellem mus. Dette er især vigtigt for modellering CRPC, som har de tilføjet variabel af kirurgisk kastration. Intra-prostatically injiceres og kastrerede mus skal følges nøje opsving og utilsigtede hændelser, som de har gennemgået to store overlevelse operationer. En anden begrænsning er tidspunktet for hver intra-prostata injektion. Dette kan reduceres til så lav som 20 min, og kirurgen assistent kan forberede den næste mus som den nuværende mus er at være sutureres. Endelig er orthotopic Myc-CaP tumorer aggressive, hurtigt voksende tumorer, der kommer til overlevelse slutpunktet i ca 46 dage (og så tidligt som 35 dage) på grund af den primære tumor masse. Undersøgelser kræver langsommere tumor udvikling eller langsigtede behandlinger bør optimeres empirisk for den første injektion celle count og behandlingen regime. I modsætning til begrænsninger af s.c. tumorer og perler, alle de ovennævnte begrænsninger af orthotopic tumor model kan overvindes, og yderligere ændringer i protokollen kan være foretaget på grundlag af individuelle eksperimentelle behov.
Som orthotopic tumor model indebærer brug af in vitro-håndteret celler, disse celler kan blive ændret afhængigt af behovene i undersøgelsen. Her, har vi ændret disse celler for at stabilt express luciferase og mCherry for i vivo tumor overvågning. Vi har også udført en CRISPR-Cas9 knockout af tumor suppressor PT, til at generere en mere aggressiv, klinisk relevante cellelinie, der vokser hurtigere som orthotopic tumorer (manuskript i anmeldelse). Med fordelene ved orthotopic tumor model, evnen til at studere både androgen-afhængige prostatakræft og CRPC og potentiale til at give udtryk for billeddiagnostiske modaliteter eller knockdown eller overexpress Vælg gener, fungerer denne protokol som en værdifuld ressource for alle prostatakræft forskning.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes sundhed tilskuddene til Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Hannes Abdulkadir (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) og Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
| Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
| Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
| 50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
| 28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
| RPMI | Gibco | 18875-093 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
| 26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
| Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
| Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
| Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
| Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
| Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
| Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
| 5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
| 4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
| Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
| D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
| Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
| Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
| Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
| Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA-Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
- Alemozaffar, M., et al. Prediction of erectile function following treatment for prostate cancer. JAMA. 306 (11), 1205-1214 (2011).
- Alibhai, S. M., et al. 30-day mortality and major complications after radical prostatectomy: influence of age and comorbidity. J Natl Cancer I. 97 (20), 1525-1532 (2005).
- Chen, R. C., Clark, J. A., Talcott, J. A. Individualizing quality-of-life outcomes reporting: how localized prostate cancer treatments affect patients with different levels of baseline urinary, bowel, and sexual function. J Clin Oncol. 27 (24), 3916-3922 (2009).
- Kohutek, Z. A., et al. Long-Term Impact of Androgen-Deprivation Therapy on Cardiovascular Morbidity after Radiotherapy for Clinically Localized Prostate Cancer. Urology. , (2015).
- Murray, L., et al. Second primary cancers after radiation for prostate cancer: a systematic review of the clinical data and impact of treatment technique. Radiother Oncol. 110 (2), 213-228 (2014).
- Resnick, M. J., et al. Long-term functional outcomes after treatment for localized prostate cancer. N Engl J Med. 368 (5), 436-445 (2013).
- Shahinian, V. B., Kuo, Y. F., Freeman, J., Goodwin, J. S. Risk of fracture after androgen deprivation for prostate cancer. New Engl J Med. 352 (2), 154-164 (2005).
- Wilke, D. R., et al. Testosterone and erectile function recovery after radiotherapy and long-term androgen deprivation with luteinizing hormone-releasing hormone agonists. BJU Int. 97 (5), 963-968 (2006).
- Zhao, J., et al. Androgen deprivation therapy for prostate cancer is associated with cardiovascular morbidity and mortality: a meta-analysis of population-based observational studies. PLoS One. 9 (9), e107516 (2014).
- Berthold, D. R., et al. Docetaxel plus prednisone or mitoxantrone plus prednisone for advanced prostate cancer: updated survival in the TAX 327 study. J Clin Oncol. 26 (2), 242-245 (2008).
- Bono, J. S., et al. Prednisone plus cabazitaxel or mitoxantrone for metastatic castration-resistant prostate cancer progressing after docetaxel treatment: a randomised open-label trial. Lancet. 376 (9747), 1147-1154 (2010).
- Fizazi, K., et al. Abiraterone acetate for treatment of metastatic castration-resistant prostate cancer: final overall survival analysis of the COU-AA-301 randomised, double-blind, placebo-controlled phase 3 study. Lancet Oncol. 13 (10), 983-992 (2012).
- Kantoff, P. W., et al. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. New Engl J Med. 363 (5), 411-422 (2010).
- Parker, C., et al. Alpha emitter radium-223 and survival in metastatic prostate cancer. New Engl J Med. 369 (3), 213-223 (2013).
- Rathkopf, D. E., et al. Updated Interim Efficacy Analysis and Long-term Safety of Abiraterone Acetate in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer Patients Without Prior Chemotherapy (COU-AA-302). Eur Urol. 66 (5), 815-825 (2014).
- Scher, H. I., et al. Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy. New Engl J Med. 367 (13), 1187-1197 (2012).
- Field, S. B., et al. Differences in vascular response between primary and transplanted tumours. Brit J Cancer. 63 (5), 723-726 (1991).
- Cowen, S. E., Bibby, M. C., Double, J. A. Characterisation of the vasculature within a murine adenocarcinoma growing in different sites to evaluate the potential of vascular therapies. Acta Oncol. 34 (3), 357-360 (1995).
- Kuo, T. H., et al. Site-specific chemosensitivity of human small-cell lung carcinoma growing orthotopically compared to subcutaneously in SCID mice: the importance of orthotopic models to obtain relevant drug evaluation data. Anticancer Res. 13 (3), 627-630 (1993).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer Meta Rev. 13 (2), 209-222 (1994).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. Int J Oncol. 3 (3), 413-422 (1993).
- Fidler, I. J. Orthotopic implantation of human colon carcinomas into nude mice provides a valuable model for the biology and therapy of metastasis. Cancer Meta Rev. 10 (3), 229-243 (1991).
- Kwon, E. D., et al. Ipilimumab versus placebo after radiotherapy in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer that had progressed after docetaxel chemotherapy (CA184-043): a multicentre, randomised, double-blind, phase 3 trial. Lancet Oncol. 15 (7), 700-712 (2014).
- Topalian, S. L., et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. New Engl J Med. 366 (26), 2443-2454 (2012).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Conway, E. M., Carmeliet, P. The diversity of endothelial cells: a challenge for therapeutic angiogenesis. Genome Biol. 5 (2), 207 (2004).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55 (4-5), 547-555 (2011).
- Bianchi-Frias, D., Hernandez, S. A., Coleman, R., Wu, H., Nelson, P. S. The landscape of somatic chromosomal copy number aberrations in GEM models of prostate carcinoma. Mol Cancer Res. 13 (2), 339-347 (2015).
- Pan, Y., et al. Characterization of chromosomal abnormalities in prostate cancer cell lines by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet. 87 (3-4), 225-232 (1999).
- Wang, J., et al. Pim1 kinase synergizes with c-MYC to induce advanced prostate carcinoma. Oncogene. 29 (17), 2477-2487 (2010).
- Watson, P. A., et al. Context-dependent hormone-refractory progression revealed through characterization of a novel murine prostate cancer cell line. Cancer Res. 65 (24), 11565-11571 (2005).
- Ellis, L., Lehet, K., Ramakrishnan, S., Adelaiye, R., Pili, R. Development of a castrate resistant transplant tumor model of prostate cancer. Prostate. 72 (6), 587-591 (2012).
- Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses. J Vis Exp. (45), (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Ellis, L., Lehet, K., Ku, S., Azabdaftari, G., Pili, R. Generation of a syngeneic orthotopic transplant model of prostate cancer metastasis. Oncoscience. 1 (10), 609-613 (2014).
- Wallace, J. Humane endpoints and cancer research. ILAR J. 41 (2), 87-93 (2000).
- Valkenburg, K. C., Amend, S. R., Pienta, K. J. Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koh, C. M., et al. MYC and Prostate Cancer. Genes Cancer. 1 (6), 617-628 (2010).
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- McNeal, J. E., Redwine, E. A., Freiha, F. S., Stamey, T. A. Zonal distribution of prostatic adenocarcinoma. Correlation with histologic pattern and direction of spread. Am J Surg Pathol. 12 (12), 897-906 (1988).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer I Monogr. 12, 1-27 (1963).
- Roy-Burman, P., Wu, H., Powell, W. C., Hagenkord, J., Cohen, M. B. Genetically defined mouse models that mimic natural aspects of human prostate cancer development. Endocr-Relat Cancer. 11 (2), 225-254 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q.
