Protocole pour la toxicité aiguë et chronique écotoxicité Testing de la Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri
Summary
Dans cet ouvrage, les auteurs décrivent un bioessai aiguë, chronique et multigénérationnelle pour étudier les effets des stresseurs simples et combinés sur le cyprinodonte Turquoise Nothobranchius furzeri. Ce protocole vise à étudier les caractéristiques démographiques (mortalité, croissance, fécondité, poids) et maximum thermique critique.
Abstract
Le cyprinodonte Nothobranchius furzeri est un organisme modèle émergents dans le domaine de l’écotoxicologie et son applicabilité des essais d’écotoxicité aiguë et chronique a été démontrée. Dans l’ensemble, la sensibilité des espèces aux composés toxiques est de l’ordre, ou plus élevé, que d’autres espèces de modèle.
Cet ouvrage décrit les protocoles de bioessais multigénérationnelles, aiguës et chroniques des effets simples et combinés de facteurs de stress sur N. furzeri. Grâce à son temps de maturation courte et cycle de vie, ce modèle vertébré permet l’étude des effets tels que la durée de maturation et de la fécondité dans les quatre mois. Transgénérationnel cycle de vie complet exposition essais peut être effectué en aussi peu que 8 mois. Puisque cette espèce produit des œufs qui sont résistantes à la sécheresse et demeurent viable pendant des années, la culture sur le site de l’espèce n’est pas nécessaire mais les particuliers peuvent être recrutées au besoin. Les protocoles visent à mesurer-caractéristiques démographiques (mortalité, croissance, fécondité, poids) et maximum thermique critique.
Introduction
Profils de sensibilité d’un tableau des espèces aux substances toxiques stratégiquement choisies ont été décrits1 pour la législation européenne REACH (enregistrement, évaluation, autorisation et Restriction des produits chimiques). Les essais de toxicité aiguë ou à court terme ont été principalement utilisés à cette fin, car ils donnent une indication rapide de la sensibilité d’une espèce. Cependant, dans leur milieu naturel, les organismes sont exposés sur une période beaucoup plus longue et cycle de vie complet ou même plusieurs générations pourraient être touchés2. En outre, organismes dans des environnements pollués sont généralement exposés à plus d’un facteur de stress à la fois, qui peuvent interagir entre eux, ce qui pourrait entraîner des effets synergiques3. Par conséquent, concentration sécuritaire calculée stresseur aigu, unique basé sur les essais de toxicité peuvent sous-estiment les risques réelles imposées par des substances toxiques dans les milieux naturels. Il est donc souhaitable d’étudier aussi les effets chroniques et multigénérationnelles de concentrations sublétales de substances toxiques dans un contexte environnemental tel que préconisé par la Commission européenne4,5 et de l’USEPA (United Environmental Protection Agency des)6,7. Surtout dans la recherche de vertébrés, les coûts en termes de travail, d’argent et le temps sont élevés lors de l’exécution des études sur l’exposition chronique et multigénérationnelles en raison de la durée de vie relativement longue des vertébrés par rapport aux organismes invertébrés modèles. Par conséquent, il est conseillé de choisir l’organisme modèle poisson plus appropriée, selon la question de recherche. En outre, un large éventail d’espèces de vertébrés devrait être disponible afin de tester la généralité des réponses diverses espèces pour pouvoir adapter la réglementation fondée sur les espèces les plus sensibles. Pour l’instant, il est nécessaire de développer de nouveaux protocoles efficaces avec des espèces de vertébrés modèle caractérisées par des cycles de vie courts pour abaisser les coûts de l’exécution des expositions chroniques et multigénérationnelles sur vertébrés7,8.
Le cyprinodonte turquoise Nothobranchius furzeri est un modèle de poisson intéressant à utiliser dans de telles expériences d’exposition à long terme en raison de son temps de maturation courte et le cycle de vie (temps de génération inférieure à 4 semaines,9). Cela signifie que des effets écologiquement pertinents tels que temps de maturation et de la fécondité peuvent être étudiés dans un court laps de temps par rapport aux autres modèles de poisson7. En outre, ces poissons produisent des oeufs résistantes à la sécheresse, dormants qui restent viables pendant plusieurs années, lorsqu’il est conservé dans des conditions normales, ce qui élimine la nécessité d’une culture continue9. Dans les études écotoxicologiques, cela implique aussi que répliquer poissons peuvent tous être éclos au même moment, résultant en synchronie de temps pour tous les animaux, même parmi les lots de œufs produits à différents moments. Nous conseillons à l’aide du laboratoire souche GRZ pour effectuer des expériences d’exposition. Cette souche effectue bien dans des conditions de laboratoire, est homozygote (à l’exception des chromosomes sexuels) et le génome est bien caractérisé10,11.
Dans les études écotoxicologiques, il est important de sélectionner la fourchette des concentrations d’essai. Plusieurs méthodes complémentaires peuvent être utilisées à cette fin. La gamme de concentration nominale peut reposer sur la sensibilité d’une espèce apparentée, comme les Nothobranchius guentheri12. Par ailleurs, la gamme peut être basée sur la sensibilité des modèles standard de poissons, comme le poisson zèbre (Danio rerio)2 qui ont une sensibilité comparable à la plupart des substances toxiques (Philippe et al. (en révision)). En combinaison, avec ces deux options, une gamme trouver expérience devrait être menée pour sélectionner la plage de concentration nominale. Aiguë de test, les chercheurs devraient viser pour les traitements de la concentration avec 100 % de mortalité, mortalité intermédiaire et 0 % de mortalité après 24 h d’exposition à la substance toxique. Chronique de test, il est conseillé d’exécuter la gamme trouver expérience pendant deux semaines afin de vérifier si la mortalité larvaire en l’état avec les plus fortes concentrations d’essai ne dépasse pas 10 % durant cette période de référence.
Le protocole peut servir de référence pour effectuer une exposition aiguë et chronique aux polluants d’origine hydrique sur furzeri N., examine les effets potentiels du stress tant au niveau individuel et cellulaire. Il peut également être utilisé pour effectuer la recherche de facteurs de stress multiples pour accommoder une pertinence écologique plus élevée, mélange de différents composés toxiques ou étudier les effets d’interaction entre la pollution et d’autres facteurs de stress physiques (p. ex. la prédation) ou anthropiques les facteurs de stress (p. ex. réchauffement due au changement climatique).
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet ouvrage décrit un nouveau bioessai utilisant Nothobranchius furzeri, un organisme modèle émergent, pour étudier l’individu et combiné les effets à long terme de substances toxiques et autres facteurs de stress. Les protocoles présentés ont été appliqués avec succès pour mesurer la sensibilité de l’espèce à un tableau des substances toxiques (cuivre, cadmium, 3, 4-dichloroaniline et chlorpyrifos). En raison de son cycle de vie rapide, ce modèle vertébré permet pour évaluation de sublét…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants envers le groupe de la sphère de la UAntwerpen et du département de protection des cultures de l’Ugent pour analyse des échantillons d’eau. Appui au cours de ce projet a été fourni par le centre d’Excellence ‘ Eco et dynamique socio-évolutive (PF/10/007) de la KU Leuven Research Fund. AFG (11Q0516N) et ESJT (FWO-SB151323) ont été financés en doctorat et TP (12F0716N) comme stagiaire post-doctoral FWO Flandre (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
Referências
- European-Chemicals-Bureau. . TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d. . Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- . Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996)
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
