Protocollo per acuto e prove di ecotossicità cronica del turchese Killifish Nothobranchius furzeri
Summary
In questo lavoro descriviamo un biotest acute, croniche e multigenerazionale per studiare gli effetti dei fattori di stress singoli che combinati sul turchese killifish Nothobranchius furzeri. Questo protocollo è progettato per studiare i tratti di storia di vita (mortalità, crescita, fecondità, peso) e critico massimo termico.
Abstract
Il killifish Nothobranchius furzeri è un organismo modello emergenti nel campo dell’ecotossicologia e sua applicabilità nelle prove di ecotossicità acuta e cronica è stata dimostrata. Nel complesso, la sensibilità della specie di composti tossici è nella gamma con, o superiore, quello di altre specie di modello.
Questo lavoro descrive protocolli per analisi biologiche acute, croniche e multigenerazionale di effetti stressor singole e combinate il N. furzeri. Grazie alla sua breve stagionatura e ciclo di vita, questo modello vertebrato permette lo studio di endpoint come tempo di maturazione e fecondità entro quattro mesi. Prove di esposizione di transgenerazionale intero ciclo di vita possono essere eseguite in appena 8 mesi. Poiché questa specie produce uova che sono resistenti alla siccità e rimangono vitale per anni, la cultura in loco delle specie non è necessario, ma gli individui possono essere reclutati quando richiesto. I protocolli sono progettati a misura tratti di storia di vita (mortalità, crescita, fecondità, peso) e critico massimo termico.
Introduction
Profili di sensibilità di una matrice di specie alle sostanze tossiche strategicamente selezionati sono stati descritti1 per la normativa europea REACH (registrazione, valutazione, autorizzazione e restrizione delle sostanze chimiche). Prove di tossicità acuta o a breve termine principalmente sono state usate per questo scopo in quanto danno una rapida indicazione di sensibilità di una specie. Tuttavia, nel loro ambiente naturale, gli organismi sono esposti per periodi molto più lunghi e cicli di vita completo o anche diverse generazioni potrebbero essere interessato2. Inoltre, organismi in ambienti inquinati in genere sono esposti a più di un fattore di stress in un momento, che può interagire con l’altro, possibilmente con conseguente effetti sinergici3. Quindi, sicuro concentrazioni calcolato basato sul fattore di stress acuto, unico test di tossicità possono sottovalutare i rischi effettivi imposti da sostanze tossiche negli ambienti naturali. Si consiglia, pertanto, anche studiare gli effetti cronici e multigenerazionale di concentrazioni subletali di sostanze tossiche in un contesto ecologicamente rilevante come sostenuto dalla Commissione europea4,5 e USEPA (Regno States Environmental Protection Agency)6,7. Particolare nella ricerca dei vertebrati, i costi in termini di lavoro, tempo e denaro sono elevati durante l’esecuzione di studi di esposizione cronica e multigenerazionale a causa la durata relativamente lunga dei vertebrati rispetto ad organismi invertebrati marini modello. Pertanto, si consiglia di scegliere l’organismo di modello più appropriato di pesce, a seconda della domanda di ricerca. Inoltre, una vasta gamma di specie di vertebrati dovrebbe essere disponibile al fine di testare la generalità delle risposte tra le specie di essere in grado di adattare i regolamenti basati sulle specie più sensibili. Per ora, c’è la necessità di sviluppare nuovi, efficienti protocolli con specie di vertebrati modello caratterizzato da cicli di vita brevi per abbassare i costi di realizzare esposizioni croniche e multigenerazionale su vertebrati7,8.
Il turchese killifish Nothobranchius furzeri è un interessante modello di pesce da utilizzare in tali esperimenti di esposizione a lungo termine a causa della sua breve stagionatura e ciclo di vita (tempo di generazione meno di 4 settimane9). Ciò significa che possono essere studiati gli endpoint ecologicamente rilevanti quali il tempo di maturazione e fecondità entro un breve lasso di tempo rispetto ad altri modelli di pesci7. Inoltre, questi pesci producono uova resistenti alla siccità, dormienti che rimangono vitali per diversi anni se conservato in condizioni standard, eliminando così la necessità di un continuo cultura9. In studi ecotossicologici, ciò implica anche che replicare pesce possono tutti essere covate nel momento esatto stesso, risultanti in sincronia di tempo per tutti gli animali, anche tra i lotti di uova prodotte in momenti diversi. Si consiglia di utilizzare il laboratorio ceppo GRZ per eseguire esperimenti di esposizione. Questo ceppo esegue bene in condizioni di laboratorio, è omozigote (ad eccezione di cromosomi sessuali) e il genoma è ben caratterizzata10,11.
In studi ecotossicologici, è importante selezionare l’appropriato intervallo di concentrazioni di prova. Diversi metodi complementari possono essere utilizzato a tal fine. La gamma di concentrazione nominale può essere basata sulla sensibilità di una specie correlata, come ad esempio Nothobranchius guentheri12. In alternativa, la gamma può essere basata sulla sensibilità dei modelli di pesce standard, come zebrafish (Danio rerio)2 che hanno una sensibilità paragonabile alla maggior parte delle sostanze tossiche (Philippe et al. (in revisione)). In combinazione, con entrambe le opzioni, un esperimento per individuare l’intervallo dovrebbe essere condotti per selezionare l’intervallo di concentrazione nominale. Per il test acuto, i ricercatori dovrebbero mirare per trattamenti a concentrazione con 100% di mortalità, mortalità intermedi e 0% di mortalità dopo 24 h di esposizione per la sostanza tossica. Per il test cronico, si consiglia di eseguire l’esperimento per due settimane verificare se mortalità larvale nella condizione con le più alte concentrazioni di prova non superi il 10% durante questo periodo di riferimento per individuare l’intervallo.
Il protocollo può servire come base per eseguire esposizione acuta e cronica alle sostanze inquinanti a base acquosa su N. furzeri, esamina gli effetti potenziali dei fattori di stress sia a livello individuale e cellulare. Può anche essere utilizzato per eseguire la ricerca multi-fattore di sforzo per accogliere una maggiore rilevanza ecologica, mescolando diversi composti tossici o studiando gli effetti interattivi tra inquinamento e altri fattori di stress naturali (es. predazione) o antropica fattori di stress (ad es. il riscaldamento dovuto ai cambiamenti climatici).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro descrive un nuovo saggio biologico usando Nothobranchius furzeri, un organismo modello emergente, per studiare l’individuo e gli effetti a lungo termine di sostanze tossiche e altri fattori di stress combinati. I protocolli presentati sono stati applicati correttamente per misurare la sensibilità delle specie in una matrice di sostanze tossiche (rame, cadmio, 3,4-dicloroanilina e Clorpirifos). A causa del suo ciclo di vita veloce, questo modello di vertebrati consente per la valutazione di subleta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al gruppo sfera dell’UAntwerpen e il dipartimento di protezione delle colture del Ugent per analisi di campioni di acqua. Supporto durante questo progetto è stato fornito dal centro di eccellenza ‘ Eco e dinamiche socio-evolutive (PF/10/007) del KU Leuven Research Fund. AFG (11Q0516N) ed ESJT (FWO-SB151323) sono stati finanziati come dottorato e TP (12F0716N) come borsista post-doc di Flanders FWO (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
Referências
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