Protokoll för akut och kronisk ekotoxicitet testning av den turkos Killifish Nothobranchius furzeri
Summary
I detta arbete beskriver vi en akut, kronisk och multigenerational bioassay för att studera effekterna av enkel- och kombinerade stressfaktorer på den turkosa killifish Nothobranchius furzeri. Detta protokoll syftar till att studera livshistoria egenskaper (dödlighet, tillväxt, fruktsamhet, vikt) och kritiska termisk maximalt.
Abstract
De äggläggande tandkarpar Nothobranchius furzeri är en framväxande modellorganism inom ekotoxikologi och dess tillämplighet i akuta och kroniska ekotoxikologiska försök har påvisats. Sammantaget är känsligheten hos arterna som giftiga föreningar i intervallet med, eller högre än, för andra modell arter.
Detta arbete beskriver protokoll för akut, kronisk och multigenerational bioassays av enkel- och kombinerade stressfaktor effekter på N. furzeri. På grund av dess korta mognad tid och livscykel tillåter denna ryggradsdjur modell studiet av slutpunkter som mognad tid och fruktsamhet inom fyra månader. Transgenerationell hela livscykeln exponering prövningar kan utföras i så lite som 8 månader. Eftersom denna art producerar ägg som är torktåliga och förbli lönsamt år, hotellets kulturen av arten behövs inte men individer kan rekryteras när det behövs. Protokollen är avsedda att mäta livshistoria drag (dödlighet, tillväxt, fruktsamhet, vikt) och kritiska termisk maximalt.
Introduction
Känslighet profiler för en rad arter till strategiskt utvalda gifter har varit beskrivs1 för bestämmelserna om EU: S REACH (registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier). Akut eller kortsiktiga toxicitetstester användes främst för detta ändamål som de ger en snabb indikation på en artens känslighet. Men i deras naturliga miljö, organismer utsätts under mycket längre tidsperioder och hela livscykel eller även flera generationer kan vara drabbade2. Dessutom utsätts vanligtvis organismer i förorenade miljöer för mer än en stressfaktor i en tid, som kan interagera med varandra, eventuellt resulterar i synergistiska effekter3. Säkra koncentrationer beräknade utifrån akut, enda stressfaktor toxicitetstester kan därför underskatta de faktiska riskerna som införts av gifter i naturliga miljöer. Det är därför tillrådligt att även studera de kroniska och multigenerational effekterna av subletala koncentrationer av gifter i ett miljömässigt relevanta sammanhang som förespråkas av Europeiska kommissionen4,5 och den amerikanska MILJÖVÅRDSMYNDIGHETEN (United States Environmental Protection Agency)6,7. Speciellt i ryggradsdjur forskning är kostnaderna för arbetskraft, pengar och tid hög när du utför kroniska och multigenerational exponeringsstudier på grund av den relativt långa livslängden hos ryggradsdjur jämfört ryggradslösa modellorganismer. Därför är det lämpligt att välja den lämpligaste fisk modell organismen, beroende på forskningsfrågan. Dessutom bör ett brett utbud av ryggradsdjur vara tillgänglig för att testa allmängiltigheten i svaren mellan arter kunna anpassa regler baserat på de mest känsliga arterna. För nu finns det ett behov av att utveckla nya, effektiva protokoll med ryggradsdjur modell arter kännetecknas av kort livscykel att sänka kostnaderna för att utföra kroniska och multigenerational exponeringar på ryggradsdjur7,8.
Den turkosa killifish Nothobranchius furzeri är en intressant fisk modell att använda i sådana långsiktiga exponering experiment på grund av dess korta mognad tid och livscykel (generationstid mindre än 4 veckor9). Detta innebär att ekologiskt relevanta endpoints som mognad tid och fruktsamhet kan studeras inom en kort tid jämfört med andra fisk modeller7. Dessutom producerar dessa fiskar torktåliga, vilande ägg som förblir lönsamt i flera år om den förvaras under normala förhållanden, vilket eliminerar behovet av en kontinuerlig kultur9. Ekotoxikologiska studier innebär detta också att replikera fisk kan alla kläckas i exakt samma ögonblick, vilket resulterar i tid synchrony för alla djur, även bland partier av ägg som produceras vid olika tidpunkter. Vi rekommenderar att använda laboratoriet GRZ stam för att utföra exponering experiment. Denna stam utför väl under laboratorieförhållanden, är homozygot (förutom könskromosomer) och genomet är väl karakteriserade10,11.
I ekotoxikologiska studier är det viktigt att markera lämpliga testkoncentrationer. Flera kompletterande metoder kan användas för detta ändamål. Den nominella koncentrationen utbud kan baseras på känsligheten hos en närstående arter, såsom Nothobranchius guentheri12. Alternativt, spänna kan baseras på standard fisk modeller, såsom zebrafisk (Danio rerio)2 som har en jämförbar känslighet för de flesta gifter (Philippe et al. känslighet (i review)). I kombination, med båda alternativen, bör en rangefinding experiment utföras för att markera det nominella koncentrationen. För akut testning, bör forskare sträva efter koncentration behandlingar med 100% dödlighet, mellanliggande och 0% mortalitet efter 24 h exponering för den för människor. För kronisk testning, är det tillrådligt att köra den rangefinding experiment i två veckor för att kontrollera om Pseudocoremia dödlighet i tillståndet med de högsta testkoncentrationerna inte överstiger 10% under denna referensperiod.
Protokollet kan fungera som en baslinje att utföra akut och kronisk exponering för vattenburna föroreningar på N. furzeri, att undersöka potentiella effekter av stressfaktorer både på individuell och cellulär nivå. Det kan också användas för att utföra flera stressfaktor forskning för att rymma en högre ekologisk relevans, blanda olika giftiga föreningar eller studerar interaktiva effekter mellan föroreningar och andra naturliga stressfaktorer (e.g. predation) eller antropogena stressfaktorer (t.ex. uppvärmning på grund av klimatförändringen).
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete beskriver en ny bioassay använder Nothobranchius furzeri, en framväxande modellorganism, för att studera enskilda och kombinerade långsiktiga effekter av gifter och andra stressfaktorer. De presenterade protokoll har tillämpats för att mäta känsligheten av arter till en matris av gifter (koppar, kadmium, 3,4-dikloranilin och klorpyrifos). På grund av dess snabba livscykel, denna ryggradsdjur modell tillåter bedömning av subletala och transgenerationell effekter inom fyra månader. En anna…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma till gruppen sfären av UAntwerpen och Institutionen för växtskydd av fås för analys av vattenprover. Stöd under detta projekt tillhandahölls av Excellence Center ‘ Eco och socio-evolutionära dynamik (PF/10/007) KU Leuven forskningsfonden. AFG (11Q0516N) och ESJT (CVE-SB151323) finansierades som doktorand och TP (12F0716N) som post-doc fellow CVE Flandern (Fonds yrkesverksamma Onderzoek).
Materials
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
Referências
- European-Chemicals-Bureau. . TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d. . Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- . Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996)
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
