Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

Resumo

Gel-seq permite aos investigadores simultaneamente preparar bibliotecas para ambos DNA - e RNA-seq insignificante custo adicionado a partir de 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas.

Resumo

A capacidade de amplificar e sequenciar o DNA ou RNA de pequenas amostras de partida só foi alcançada nos últimos cinco anos. Infelizmente, os protocolos padrão para gerar genômica ou transcriptomic bibliotecas são incompatíveis e pesquisadores devem escolher-se para sequenciar o DNA ou RNA para uma determinada amostra. Gel-seq resolve esse problema permitindo que pesquisadores preparar simultaneamente bibliotecas para DNA e RNA, começando com 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas. Nós projetamos Gel-seq para que ele pode ser facilmente implementado por outros pesquisadores; muitos laboratórios de genética já tem o equipamento necessário para reproduzir a fabricação do dispositivo de Gel-seq. Nosso protocolo emprega comumente usados kits para ambos os todo-transcrição de amplificação (WTA) e preparação da biblioteca, que também são susceptíveis de ser familiar para os investigadores já versado na geração de genômica e transcriptomic bibliotecas. Nossa abordagem permite que os pesquisadores trazer para suportar o poder de sequenciamento de DNA e o RNA em uma única amostra sem divisão e com custo insignificante adicionado.

Introdução

Próxima geração (NGS) de sequenciamento teve um profundo impacto no caminho a pesquisa genética é realizada. Onde pesquisadores uma vez focada no sequenciamento do genoma de uma espécie inteira, é agora possível sequenciar o genoma de um tumor único ou até mesmo uma única célula em um experimento. ¹ NGS também tornou rentável para sequenciar os transcritos de RNA encontrados dentro de uma célula, uma coleção de dados conhecidos como a transcriptoma. A capacidade de amplificar e sequenciar o DNA ou RNA de pequenas amostras de partida só foi alcançada nos últimos cinco anos. ^{2 , 3 ,<....}

Protocolo

1. preparação da solução química

Nota: Os passos seguintes são para a preparação de soluções químicas necessárias em etapas posteriores. Estes podem ser feitos em grandes quantidades e armazenados por vários meses.

1. Para começar, prepare-se 50 mL de água purificada, deionizada esterilização em 254 nm UV reticulação forno por 15 min (15 mJ/cm² exposição total) neutralizar qualquer DNA contaminante. Calor de 37 ° C para uso em etapas a seguir.
2. Fazer 10 mL de um 40% total (T) e 3,3% crosslinker (C) (29:1) solução de precursor de poliacrilamida. Pese 3,867 g de monômero de acrilamida e 0,133 g de monômero de bis-ac....

Resultados

A separação física dos híbridos gDNA e cDNA/RNA em Gel-seq dispositivo pode ser visualizada através de imagens de gel fluorescente; um resultado representativo é mostrado na Figura 3. Painel A mostra o dispositivo Gel-seq fabricado; falsa cor foi adicionada para distinguir as gel de diferentes regiões. Painel B aparece um close de quatro separações diferentes usadas para validação. A terceira pista, um controlo negativo, representa o plano de fundo e mostra q.......

Discussão

Existem vários passos críticos associados com a fabricação do dispositivo de Gel-seq, bem como o protocolo em si. Durante a fabricação, recomendamos começar com as espessuras de camada prescritos para as diversas regiões do gel. Passamos um tempo significativo teste opções de fabricação diferentes e o protocolo descrito aqui produz os melhores dispositivos para as fitas listadas na tabela de materiais e reagentes. Se pesquisadores usam um sistema alternativo de gaveta, eles podem ser necessário ajustar o.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
Monômero de Acrilamida	Sigma Aldrich	A8887-100G
Persulfato de Amônio	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referido no texto como grânulos de imobilização reversível em fase sólida (SPRI)
Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referido no texto como corante de carregamento 6X
Álcool etílico	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST Kits de qRT-PCR de uma etapa	Kapa BioSystems	7959613001	Referido no texto como mistura 2X qPCR
N,N′-Metilenobis(acrilamida)	Sigma Aldrich	146072-100G	Também conhecido como bis-acrilamida
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referido no texto como kit de preparação de biblioteca)	Illumina	FC-131-1024	Inclui: TD (referido no texto como buffer de transposase), ATM (referido no texto como transposase), NT (referido no texto como buffer de parada de transposase) e NPM (referido no texto como mistura de PCR de preparação de biblioteca)
Água	livre de nucleaseKit Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 (referido no texto como kit de amplificação de transcrição completa (WTA))	Takara/Clontech	634888	Inclui: Tampão de lise, inibidor de RNase, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (referido no texto como RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referido no texto como buffer de primeira fita), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referido no texto como oligonucleotídeo de troca de modelo (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referido no texto como transcriptase reversa) e PCR Primer II A (referido no texto como cDNA PCR primer)
Hexâmero aleatório com adaptador WTA	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sacarose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Descontaminante de Superfície	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referido no texto como produto de remoção de DNA
Tampão Tris-Borato-EDTA (concentração de 10X)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrado em DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referido no texto como mancha de gel
Equipamento
BD Precisionglide  agulhas de seringa, calibre 18	Sigma Aldrich	Z192554	Qualquer hardware equivalente é aceitável
Banho ultrassônico da série Branson CPX	Sigma Aldrich	Z769363	Qualquer hardware equivalente é aceitável
de gel vazios, mini, 1,0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Qualquer hardware equivalente é aceitável
Placa de Filtro de Malha - Corning  HTS Transwell 96 suportes permeáveis de poços - 8.0 µ m tamanho do poro	Sigma Aldrich	CLS3374	Referido no texto como placa de filtro de malha de 8 um
PowerPac HC Fonte de Alimentação	Bio-Rad	1645052	Qualquer hardware equivalente é aceitável
Fluorômetro Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33216	Qualquer hardware equivalente é aceitável
Concentrador Vacufuge	Eppendorf	22822993	Qualquer hardware equivalente é aceitável
Sistema de mini-célula XCell SureLock	ThermoFisher Scientific	EI0001	Qualquer hardware equivalente é aceitável
Sistema de detecção de PCR em tempo real Bio-Rad CFX96 Touch	Bio-Rad	1855195	Qualquer hardware equivalente é aceitável
Amersham UVC 500 Reticulador Ultravioleta	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Descontinuado, qualquer hardware equivalente é aceitável
Gel Doc XR+ Sistema de Documentação de Gel	Bio-Rad	1708195	Referido no texto como gerador de imagens em gel
Transiluminador Dark Reader	Clare Chemical	Research DR89	Referido no texto como transiluminador UV
Ultrassônico  Banho	Bransonic	1207K35	Qualquer banho ultrassônico equivalente é aceitável.

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