Aanpassing 3' de snelle versterking van CDNA uiteinden kaart afschriften bij kanker

Summary

De twee verschillende 3′ snelle versterking van cDNA uiteinden (3′ RACE) protocollen beschreven hier maken gebruik van twee verschillende polymerase van DNA sequenties die bevatten een segment van het open leesraam (ORF), de stop codon en de gehele 3′ UTR van een afschrift van het gebruik van RNA in kaart verkregen cellijnen van andere kanker.

Abstract

Rijping van eukaryotische mRNAs omvat 3′ eind vorming, waarbij de toevoeging van een poly(A) staart. Om de kaart van de 3′-eind van een gen, is de traditionele methode van keuze 3′ de snelle versterking van cDNA uiteinden (3′ RACE). Protocollen voor 3′ RACE vereisen het zorgvuldige ontwerp en de selectie van genestelde inleidingen binnen de 3′ niet-vertaalde regio (3′ UTR) van het target-gen van belang. Echter, met een paar wijzigingen het protocol kan worden gebruikt met de gehele 3′ UTR en sequenties binnen het open leesraam (ORF), die een vollediger beeld van de relatie tussen de ORF en de 3′ UTR. Dit is naast de identificatie van het polyadenylatie signaal (BK), evenals de website van het decolleté en polyadenylatie geboden door conventionele 3′ RACE. Uitgebreide 3′ RACE kan detecteren ongebruikelijke 3′ UTRs, met inbegrip van gene fusies binnen de 3′ UTR, en de reeks informatie kan worden gebruikt om te voorspellen van potentiële miRNA bandplaatsen evenals AU rijke destabiliserende elementen die de stabiliteit van het transcript kunnen beïnvloeden.

Introduction

De vorming van de 3′-eind is een cruciale stap in de maturatie van mRNA dat bestaat uit het splijten van de pre-mRNA stroomafwaarts van een PAS gevolgd door de toevoeging van ~ 250 untemplated adenines, waaruit de poly(A) staart^1,2. De poly(A)-bindend-proteïne (PABP) bindt aan de staart van de poly(A), en dat de transcriptie van mRNA beschermt tegen afbraak, en vergemakkelijkt vertaling¹.

Huidige schattingen blijkt dat 70% van menselijke genen meerdere PASs hebben, en dus het ondergaan van alternatieve polyadenylatie, wat resulteert in meerdere 3′ einden³. Het is dus belangrijk om te identificeren waar de poly(A) staart hecht aan de rest van de 3′ UTR, evenals het identificeren van de PAS gebruikt door een bepaald afschrift. De komst van de volgende generatie sequencing heeft geleid tot de gelijktijdige identificatie van de 3′ UTRs en de PASs van duizenden genen. Deze toename van sequencing mogelijkheden heeft de ontwikkeling van bioinformatic algoritmen voor het analyseren van gegevens met betrekking tot alternatieve polyadenylatie van de 3′-eind vereist. Voor de detectie van DOVO of validering van de PAS en vandaar in kaart brengen van 3′ eind van afzonderlijke genen van grootschalige sequencing gegevens, blijft 3′ RACE de methode van keuze^4,5. De sequenties die zijn opgenomen in de cDNA producten van 3′ RACE normaal bevatten slechts een gedeelte van de 3′ UTR waarin de poly(A) staart, de breukzijde, de PAS en de sequenties stroomopwaarts van de PAS. In tegenstelling tot de PCR, waarvoor het ontwerp en gebruik van gene specifieke voorwaartse en omgekeerde inleidingen, vereist 3′ RACE alleen twee gene specifieke geneste voorwaartse primers. Vandaar, PCR vereist een meer gedetailleerde kennis van de nucleotide-volgorde van een groot gebied van het gen wordt versterkte^4,6. Aangezien 3′ RACE gebruikt keren hetzelfde primer dat doelstellingen de poly(A) staart voor alle polyadenylated RNA afschriften, alleen de voorwaartse inleidingen moeten gene specifieke, dus alleen vereist kennis van een aanzienlijk kleinere regio van het mRNA. Hierdoor is de versterking van de regio’s waarvan sequenties niet volledig gekenmerkt^{4,7 zijn}. Dit heeft toegestaan 3′ RACE worden gebruikt niet alleen om te bepalen van de 3′-eind van een gen, maar om ook bepalen en karakteriseren van grote gebieden stroomopwaarts van de PAS die een aanzienlijk deel van de 3′ UTR vormen. Door het combineren van 5′ RACE met de gewijzigde 3′ RACE die grotere porties van de 3′ UTR en flankerende gebieden omvat, is het mogelijk om volledig volgnummer of kloon van een hele mRNA transcriptie van het einde 5′ aan de 3′-eind⁸.

Een voorbeeld van deze toepassing van gemodificeerde 3′ RACE is de recente identificatie van een roman CCND1-MRCK fusion gene transcriptie van mantel cel lymfoom cellijnen en kankerpatiënten. De 3′ UTR bestond uit sequenties van genen van zowel de CCND1 als MRCK en was recalcitrante aan miRNA voorschrift⁹. De twee geneste CCND1 specifieke voorwaartse primers zijn complementair aan de regio onmiddellijk aangrenzende en “downstream” van de CCND1 stop codon. Hoewel de hele transcriptoom sequentie samen met specifieke bioinformatic hulpmiddelen kan worden gebruikt voor het detecteren van gene fusies binnen de 3′-UTR¹⁰, vele labs kunnen onvoldoende financiële middelen of bioinformatic deskundigheid om te maken gebruik van deze technologie. Vandaar, 3′ RACE is een alternatief voor DOVO identificatie en validatie van nieuwe fusion genen met betrekking tot de 3′ UTR. Gezien de drastische toename van het aantal gerapporteerde fusion genen, alsmede afschriften doorlezen, 3′ RACE uitgegroeid tot een krachtig instrument in het karakteriseren van gen-sequenties^11,12. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat verschillende reeksen binnen de 3′ UTR, evenals de lengte van de 3′ UTR kan invloed hebben op mRNA transcript stabiliteit, lokalisatie, vertaalbaarheid en functie¹³. Gedeeltelijk het gevolg van een verhoogde belangstelling voor in kaart brengen van de transcriptome, is er een toename van het aantal verschillende polymerase van DNA wordt ontwikkeld voor gebruik in het lab. Het is belangrijk om te bepalen wat typen wijzigingen kunnen worden aangebracht in de 3′ wedstrijdprotocol in om te gebruiken het beschikbare repertoire van de polymerase van DNA.

Dit werk verslagen aanpassing 3′ RAS om de gehele 3′ UTR in kaart, de PAS, en de 3′ eind breukzijde van het afschrift van de ANKHD1 met behulp van geneste inleidingen binnen de ANKHD1 afdeling van de chat-kopie en twee verschillende DNA-polymerase.

Protocol

Een laboratoriumjas, handschoenen en veiligheidsbril dragen te allen tijde tijdens het uitvoeren van alle procedures in dit protocol. Ervoor zorgen dat de containers/buizen met de fenol en guanidine isothiocyanaat reagens alleen worden geopend in een gecertificeerde kap, en de afzet van fenol afval in een container aangewezen. Het gebruik van steriele buizen DNAse/RNAse-vrije, tips, en reagentia. 1. de celkweek Groeien de cellijn van HeLa en twee schorsing mantel cel lymfoom cellijne…

Representative Results

Geneste voorwaartse Primer zoeken: De agarose gel van Figuur 1 toont twee verschillende PCR gel producten (banen 1 en 2) die gebruik hetzelfde toekomen primer maar verschillende omgekeerde inleidingen. Lane 3 heeft een onderscheiden PCR product en heeft een aparte voorwaartse en omgekeerde primer. De ideale inleidingen te gebruiken voor de PCR gebaseerde reactie zijn die een onderschei…

Discussion

Ondanks de komst van massale parallelle sequencing technologieën, op basis van het gen-door-gen, blijft 3′ RACE de gemakkelijkste en meest economische methode om de PAS en nucleotiden grenzend aan de staart van de poly(A) te identificeren. De hier beschreven aanpassing breidt uit met behulp van 3′ RACE te versterken én sequenties die ook een deel van de ORF, de stop codon en de gehele 3′ UTR van het afschrift van de mRNA ANKHD1 kaart. Een groot voordeel van 3′ RACE is dat de producten van 3′ RACE met een paar …

Materials

HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.