3 ' 快速扩增 CDNA 末端, 以图记录癌症

Summary

在这里描述的两种不同的 3 ‘ 快速扩增的 cDNA 结束 (3 ‘ 种族) 协议使用两种不同的 DNA 聚合酶来映射序列, 包括开放阅读框架 (ORF) 的一部分, 停止密码子, 和整个 3 ‘ UTR 的成绩单使用 RNA从不同的癌细胞系获得的。

Abstract

真核基因的成熟涉及 3 ‘ 端形成, 这涉及到增加一个聚 (a) 尾。为了图 3 ‘ 末端的基因, 传统的选择方法是 3 ‘ 快速扩增的 cDNA 末端 (3 ‘ 种族)。3 ‘ 种族协议需要仔细设计和选择嵌套底漆在 3 ‘ 未翻译的区域 (3 ‘ UTR) 的目标基因感兴趣。然而, 通过一些修改, 该协议可用于包括整个 3 ‘ UTR 和序列在开放阅读框架 (ORF), 提供了一个更全面的图片与 3 ‘ UTR 之间的关系。这是除了识别的 polyadenylation 信号 (PAS), 以及分裂和 polyadenylation 网站提供的常规 3 ‘ 种族。扩展 3 ‘ 种族能发现异常的 3 ‘ UTRs, 包括基因融合在 3 ‘ UTR 之内, 并且序列信息可以被使用预测潜在的 miRNA 结合的站点和不稳定的元素可能影响成绩单的稳定。

Introduction

3 ‘ 末端的形成是 mrna 成熟的一个关键步骤, 它包括 PAS 的前 mRNA 下游的分裂, 然后加上 250 untemplated adenines, 组成了聚 (a) 尾^1,2。聚 (a) 结合蛋白 (PABP) 绑定到聚 (a) 尾, 这保护 mRNA 转录不退化, 并促进翻译¹。

目前的估计表明, 70% 的人类基因有多个通过, 从而接受替代的 polyadenylation, 导致 3 ‘ 末端³。因此, 重要的是要确定多 (A) 尾附加到 3 ‘ UTR 的其余部分, 并确定任何给定的成绩单使用的考绩制度。下一代测序的出现导致了同时识别 3 ‘ UTRs 和成千上万基因的通过。这种测序能力的提高需要开发生物信息学算法来分析涉及 3 ‘ 端的替代 polyadenylation 的数据。对于 “从头” 检测或验证 PAS, 从而从大型序列数据中映射单个基因的 3 “结束”, 3 ‘ 种族仍然是选择^4,5的方法。在 3 ‘ 种族的 cDNA 产品中包含的序列通常只包括 3 ‘ UTR 的一部分, 其中包含了聚 (a) 尾、解裂部位、pas 和 pas 上游的序列。不像 PCR, 这需要设计和使用的基因特异正向和反向引物, 3 ‘ 种族只需要两个基因特定的嵌套前引物。因此, PCR 要求更详细地了解被放大的基因的大区域的核苷酸序列^4,6。由于 3 ‘ 种族使用相同的反向底漆为所有 polyadenylated RNA 记录的聚 (A) 尾, 只有向前引物需要基因特异性, 因此, 只需要知识的 mRNA 的一个显着较小的区域。这使序列未完全特征化的区域放大^4、7。这使得 3 ‘ 种族不仅用于确定一个基因的 3 ‘ 末端, 而且还确定和描述在 PAS 上游的大区域, 形成了 3 ‘ UTR 的重要部分。通过将 5 ‘ 种族与修改后的 3 ‘ 种族相结合, 其中包括 3 ‘ UTR 和侧翼区域的较大部分, 可以完全序列化或克隆从 5 ‘ 端到其 3 ‘ 端⁸的整个 mRNA 记录。

这种应用的修改 3 ‘ 种族的例子是最近鉴定的新的CCND1-MRCK融合基因转录从地幔细胞淋巴瘤细胞系和癌症患者。3 ‘ UTR 包括来自CCND1和MRCK基因的序列, 并被顽固地 miRNA 调节⁹。两个嵌套CCND1特定正向引物与CCND1停止密码子的相邻和下游区域互补。虽然整个转录测序连同特定的生物信息学工具可以用于检测 3 ‘ UTR 10 中的基因融合, 但许多实验室可能缺乏利用这项技术的财力资源或生物信息学专业知识.因此, 3 ‘ 种族是一个替代的诺新识别和验证的新型融合基因涉及 3 ‘ UTR。考虑到已报道的融合基因的数量急剧增加, 以及通过成绩单阅读, 3 ‘ 种族已经成为一个强大的工具, 以表征基因序列^11,12。此外, 最近的研究表明, 在 3 ‘ UTR 和 3 ‘ UTR 的长度不同的序列可能影响 mRNA 转录稳定性, 本地化, 可译性和功能¹³。部分原因是对绘制转录的兴趣增加, 在实验室中开发的不同 DNA 聚合酶的数量有所增加。重要的是要确定哪些类型的修改可以对 3 ‘ 种族协议, 以利用现有的 DNA 聚合酶的曲目。

此工作报告通过使用ANKHD1中ANKHD1部分中的嵌套底漆和两个不同的 DNA 聚合酶, 调整 3 ‘ 种族, 以映射整个 3 ‘ UTR、PAS 和 3 ‘ 末端解切站点成绩单。

Protocol

在执行本协议中的所有步骤时, 始终佩戴实验室大衣、手套和安全眼镜。确保含有苯酚和异硫氰酸胍试剂的容器/管只在经认证的罩盖中打开, 并在指定容器中处理苯酚废料。使用 DNAse/RNAse 无菌管, 提示和试剂。 1. 细胞培养 生长的 HeLa 细胞线和两个悬浮地幔细胞淋巴瘤细胞系, Granta-519 和 Jeko-1, 在 DMEM 含有10% 血清和 100 U/毫升青霉素/链霉素在一个湿润的孵化器与 5% CO2…

Representative Results

嵌套正向底漆搜索: 琼脂糖凝胶来自图 1显示两种不同的 PCR 凝胶产品 (车道1和 2), 使用相同的正向底漆, 但不同的反向底漆。3车道有一个独特的 PCR 产品, 并有一个明显的向前和反向底漆。用于 pcr 反应的理想引物是那些给出一个独特的 pcr 产品 (车道 3)。在1和2车道上使用的正向底漆给出了最强?…

Discussion

尽管大规模并行测序技术的出现, 在基因的基础上, 3 ‘ 种族仍然是最简单和最经济的方法, 以确定的 PAS 和核苷酸相邻的聚 (a) 尾。这里描述的适应扩展使用 3 ‘ 种族放大和地图序列包括部分的 ORF, 停止密码子, 和整个 3 ‘ UTR 的ANKHD1 mRNA 转录。3 ‘ 种族的一个主要优势是, 有几个小的适应, 从 3 ‘ 种族的产品可以克隆成其他载体, 以促进下游审讯 3 ‘ UTR 功能, 包括 miRNA 靶点, 稳定性检测以及其他机?…

Materials

HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.