Tilpasse 3 slutter raske forsterkning av CDNA å tilordne utskrifter i kreft

Summary

To forskjellige 3′ rask forsterkningen på cDNA ender (3′ RACE) protokoller beskrevet her gjør bruk av to forskjellige DNA polymerases tilordne sekvenser som inkluderer et segment åpent lesing (ORF), stopp codon, og det hele 3′ UTR av en utskrift ved hjelp av RNA Hentet fra ulike kreftcelle linjer.

Abstract

Modning av eukaryote mRNAs innebærer 3 slutten formasjon, som involverer tillegg av en poly(A) hale. For å tilordne 3 slutten av et gen, er den tradisjonelle metoden valgfrihet 3 raske forsterkning av cDNA ender (3′ RACE). Protokoller for 3′ rase krever forsiktig design og utvalg av nestede primere i 3 uoversatt regionen (3′ UTR) i målet genet av interesse. Men med noen modifikasjoner kan protokollen brukes å inkludere hele 3′ UTR og sekvenser fra åpent lesing rammen (ORF), gir en mer helhetlig bilde av forholdet mellom ORF og de 3′ UTR. Dette er i tillegg til identifikasjonen av polyadenylation (PAS), samt webområdet cleavage og polyadenylation levert av konvensjonelle 3′ rase. Utvidet 3′ rase kanne merker uvanlig 3′ UTRs, inkludert gene fusjoner i de 3′ UTR, og rekkefølgen informasjonen kan brukes til å forutsi mulige miRNA bindende områder samt AU rik destabiliserende elementer som kan påvirke stabiliteten i transkripsjon.

Introduction

Dannelsen av 3 slutten er en avgjørende skritt i mRNA holdbarhet som består i spalting av det pre-mRNA nedstrøms av en PAS etterfulgt av tillegg av ~ 250 untemplated adenines, som utgjør poly(A) hale^1,2. Poly(A) binding protein (PABP) binder til poly(A) halen, og dette beskytter mRNA transkripsjon fra fornedrelse, og forenkler oversettelse¹.

Aktuelle anslår foreslå at 70% av menneskets gener har flere PASs, og dermed gjennomgå alternative polyadenylation, som resulterer i flere 3 ender³. Derfor er det viktig å identifisere der poly(A) halen festes til resten av de 3′ UTR, i tillegg til å identifisere PAS brukes av noen gitt transkripsjon. Bruk av neste generasjons sekvensering har resultert i samtidige identifikasjon av 3′ UTRs og PASs av gener. Denne økningen i sekvensering evnen har krevd utvikling av bioinformatic algoritmer å analysere data med alternative polyadenylation 3 slutten. For de novo søket eller validering av PAS og dermed tilordning av 3 slutten av enkelte gener fra storskala sekvensering data, forblir 3′ rase metoden for valg^4,5. Sekvenser med i cDNA produkter av 3′ rase vanligvis inkluderer bare en del av de 3′ UTR som inneholder poly(A) halen, webområdet cleavage, PAS og sekvenser oppstrøms av PAS. I motsetning til PCR, som krever design og bruk av genet bestemt forover og bakover grunning, krever 3′ RACE bare to genet bestemt nestede frem primere. Derfor krever PCR mer detaljert kunnskap om nukleotid sekvensen av et stort område av genet blir forsterket^4,6. Siden 3′ rase bruker omvendt samme primer at mål poly(A) hale for alle polyadenylated RNA transkripsjoner, bare videresende primerne må være genet spesifikke, dermed kun krever kunnskap om en betydelig mindre region av mRNA. Dette gjør forsterkningen på områder som sekvensene ikke er fullt preget^4,7. Dette har tillatt 3′ rase ikke bare å finne 3 slutten av et gen, men å også bestemme og karakterisere store regioner oppstrøms PAS som utgjør en betydelig del av de 3′ UTR. Ved å kombinere 5′ løp med den endrede 3′ rase som inkluderer større deler av de 3′ UTR og flankemanøveren regioner, er det mulig å fullstendig rekkefølge eller klone en hele mRNA utskrift fra 5′ slutten til sin 3 slutten⁸.

Et eksempel på dette programmet av endrede 3′ rase er siste identifikasjon av en roman CCND1-MRCK fusion genet utskrift fra mantelen celle lymfom cellelinjer og pasienter. De 3′ UTR besto av sekvenser fra både CCND1 og MRCK gener og var motvillig til miRNA regulering⁹. To nestede CCND1 bestemt frem primerne var komplementær til regionen umiddelbart tilstøtende og nedstrøms CCND1 stopp codon. Selv om hele transcriptome sekvensering med bestemte bioinformatic verktøy kan brukes til å oppdage genet fusjoner i de 3 UTR¹⁰, mange laboratorier kan mangle den økonomiske ressurser eller bioinformatic kompetanse til å gjøre bruk av denne teknologien. Derfor er 3′ RACE et alternativ for de novo identifikasjon og validering av romanen fusion gener som involverer den 3′ UTR. Vurderer drastisk økning i antallet rapporterte fusion gener som lese gjennom transkripsjoner, har 3′ rase blitt et kraftig verktøy i karakteriserer genet sekvenser^11,12. I tillegg har studier vist at forskjellige sekvenser i de 3′ UTR samt lengden på den 3′ UTR kan påvirke mRNA transkripsjon stabilitet, lokalisering, translatability og funksjonen¹³. Delvis på grunn av en økt interesse i kartlegging av transcriptome, har det vært en økning i antall forskjellige DNA polymerases utviklet for bruk i laboratoriet. Det er viktig å finne ut hva endringstypene kan gjøres til 3′ rase protokoll i å utnytte det tilgjengelige repertoaret av DNA polymerases.

Dette arbeidet rapporter tilpasse 3′ rase å kartlegge den hele 3′ UTR, PAS og 3 slutten cleavage området av ANKHD1 transkripsjon ved hjelp av nestede primere i delen ANKHD1 transkripsjon og to forskjellige DNA polymerases.

Protocol

Bruk en labfrakk, hansker og vernebriller når du utfører alle prosedyrer i denne protokollen. Kontroller at beholdere/rør med fenol og guanidine isothiocyanate reagens bare åpnes i en sertifisert hette, og kast fenol avfall i en egen beholder. Bruk DNAse RNAse-fri sterilt rør, tips og reagenser. 1. celle kultur Vokse HeLa celle linjen og to suspensjon mantelen celle lymfom cellelinjer, Granta-519 og Jeko-1, i DMEM som inneholder 10% FBS og 100 U/mL Penicillin/Streptomycin i en f…

Representative Results

Nestede frem Primer søk: Agarose gel fra Figur 1 viser to ulike PCR gel produkter (baner 1 og 2) som Bruk samme Videresend primer men forskjellige omvendt primere. Lane 3 har en distinkt PCR-produkt og en tydelig forover og bakover grunning. Ideell primerne bruke for PCR basert reaksjonen er de som gir en tydelig PCR produktet (Lane 3). Fremover primer brukes i baner 1 og 2 gir sterke…

Discussion

Til tross for bruk av massiv parallelle sekvensering teknologi på gene-av-genet basis, fortsatt 3′ rase den enkleste og mest økonomiske metoden å identifisere PAS og nukleotider tilstøtende poly(A) halen. Tilpasningen beskrevet her utvider bruker 3′ rase både forsterke og tilordne sekvenser som inkluderer en del av ORF, stopp codon og det hele 3′ UTR av ANKHD1 mRNA transkripsjon. En stor fordel med 3′ rase er at med noen mindre tilpasninger, kan produkter fra 3′ rase klones i andre vektorer å lette nedstr?…

Materials

HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.