Адаптация 3' Быстрая амплификация CDNA заканчивается для сопоставления стенограммы в раке
Summary
Два разных 3′ быстрого амплификация cDNA концы (3′ гонки) протоколы описанных здесь делают использование двух разных ДНК полимеразы для сопоставления последовательности, которые включают сегмент кадр открытом чтения (ORF), стоп-кодон, и всего 3′ УТР Стенограмма с помощью РНК полученные от разных рак клеточных линий.
Abstract
Созревание эукариотические мРНК включает в себя 3′ конца образование, которое включает в себя добавление poly(A) хвост. Для того, чтобы карта 3′ конца гена, традиционным методом выбора является 3′ быстрого амплификация cDNA концы (3′ гонки). Протоколы для 3′ гонки требуют тщательного проектирования и выбора вложенных грунтовки в течение 3′ непереведенные региона (3′ УТР) целевого гена интереса. Однако с несколькими изменениями протокол может использоваться для включения всего 3′ УТР и последовательности в рамках открытого чтение (ORF), обеспечивая более полное представление о взаимосвязи между ОРФ и 3′ УТР. Это в дополнение к идентификации сплайсингу сигнала (ССА), а также на сайте расщепления и сплайсингу, предоставляемый обычных 3′ гонки. Расширенный 3′ РАСЫ может обнаружить необычные 3′ необычных, включая гена сплавливания в течение 3′ УТР, и последовательность информация может использоваться для прогнозирования потенциальных Мирна привязки сайтов, а также AU богатые дестабилизирующих элементов, которые могут повлиять на стабильность транскрипт.
Introduction
Формирование 3′ конца является важнейшим шагом в мРНК созревания, который включает расщепления пре мРНК вниз по течению ПА с последующим добавлением ~ 250 untemplated adenines, которые составляют1,хвост poly(A)2. Poly(A) привязки белка (РАВР) связывается с poly(A) хвост, и это защищает мРНК Стенограмма от деградации и облегчает перевод1.
Текущие оценки показывают, что 70% генов человека несколько перевал и таким образом пройти альтернативный сплайсингу, что приводит к несколько 3′ конца3. Таким образом важно определить, где хвост poly(A) придает остальной части 3′ УТР, а так же определить PAS, используемые любой данной транскрипт. С появлением следующего поколения секвенирования привело к одновременной идентификации 3′ необычных и перевал тысяч генов. Это увеличение возможности виртуализации требуется разработка bioinformatic алгоритмов для анализа данных, связанных с альтернативными сплайсингу 3′ конца. Для обнаружения de novo или проверки системы служебной аттестации и следовательно сопоставления 3′ конца отдельных генов из последовательности данных большого объема 3′ гонки остается метод выбора4,5. Последовательностей, обычно включаются в cDNA продукции 3′ РАСЫ включают только часть 3′ УТР, содержащий poly(A) хвост, на сайте расщепления, ССА и последовательности вверх по течению ССА. В отличие от PCR, который требует разработки и использования конкретных прямого и обратного праймеров гена, 3′ гонка требует только два гена конкретных вложенных вперед грунтовки. Следовательно PCR требует более детального знания нуклеотидной последовательности гена, усиленные4,6большого региона. С 3′ гонка использует то же обратный грунтовка, что цели, poly(A) хвост для всех polyadenylated РНК стенограммы, только вперед грунтовки должны быть ген конкретные, таким образом, только требует знания значительно меньше региона мРНК. Это позволяет амплификацию регионов, чьи последовательности не являются полностью характеризуется4,7. Это позволило 3′ гонки использоваться не только для определения 3′ конца гена, но также определить и охарактеризовать крупных регионах вверх по течению ССА, которые составляют значительную часть 3′ УТР. Объединив 5′ гонки с модифицированных 3′ раса, которая включает в себя большие части 3′ УТР и фланкируя регионов, можно полностью последовательности или клонировать весь мРНК Стенограмма от 5′ конца его 3′ конца8.
Пример этого применения модифицированных 3′ гонка является недавнее идентификация Роман CCND1-MRCK фьюжн гена Стенограмма от линии Мантия клеточная лимфома клетки и больных раком. 3′ УТР состояла из последовательностей из как CCND1 , так и MRCK генов и был непокорным Мирна правила9. Два вложенных CCND1 конкретных вперед грунтовки дополняют региона непосредственно прилегающих и вниз по течению от CCND1 остановки кодон. Хотя весь транскриптом последовательности вместе с конкретными bioinformatic инструменты могут использоваться для обнаружения гена сплавливания в течение 3′ УТР10, многие лаборатории могут не хватает финансовых ресурсов или bioinformatic опыт, чтобы сделать использование этой технологии. Следовательно 3′ гонка является альтернативой для de novo идентификации и проверки Роман фьюжн генов, связанных с 3′ УТР. Учитывая резкое увеличение числа зарегистрированных фьюжн генов, а также прочитать транскрипты, 3′ гонка стала мощным инструментом в характеристике генных последовательностей11,12. Кроме того недавние исследования показали, что различные последовательности в течение 3′ УТР, а также длина 3′ УТР может повлиять на стенограмму стабильность мРНК, локализации, переводимости и функции13. Отчасти объясняется повышенный интерес в сопоставлении транскриптом, наблюдается увеличение числа различных ДНК-полимеразы, разрабатываются для использования в лаборатории. Важно определить, какие типы изменений можно внести 3′ гонка протокола для того, чтобы использовать доступные репертуар полимераз.
Эта работа, доклады адаптации 3′ гонки на карте всего 3′ УТР, PAS и 3′ конца расщепления сайт ANKHD1 транскрипт с помощью вложенных грунтовки в рамках секции ANKHD1 транскрипт и два разных полимераз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на появление массивной параллельной последовательности технологий, на основе гена в геном, 3′ гонки по-прежнему остается наиболее простой и экономичный метод для идентификации PAS и нуклеотидов, прилегающих к poly(A) хвост. Адаптация, описанные здесь расширяется с помощью 3′ гонки к…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы признать Bettine Gibbs за ее техническую помощь.
Materials
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | Cervical cancer cell line. |
| Jeko-1 cells | ATCC | CRL-3006 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Granta-519 cells | DSMZ | ACC-342 | Mantle cell lymphoma cell line. |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal bovine serum for cell culture. |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisherScientific | 15140122 | Antibiotic and antimycotic. |
| GlycoBlue | Ambion | AM9545 | Coprecipitant. |
| DMEM | ThermoFisherScientific | 10569044 | Gibco brand cell culture media with GlutaMAX. |
| Nuclease Free-Water | ThermoFisherScientific | AM9938 | Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated). |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution | Corning | 21-030 | 1X PBS. |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| 2-propanol | Sigma Aldrich | I9516 | |
| Reagent Alcohol | Sigma Aldrich | 793175 | Ethanol |
| Ethidium Bromide solution | Sigma Aldrich | E1510 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisherScientific | 15596026 | Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent. |
| 2X Extender PCR-to-Gel Master Mix | Amresco | N867 | 2X PCR-to-Gel Master Mix containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search. |
| 10mM dNTP | Amresco | N557 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | Dnase treatment kit. |
| Gel Loading Dye Orange (6X) | New England BioLabs | B7022S | |
| 2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer | ThermoFisherScientific | F531S | 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents. |
| PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase | Agilent Technologies | 600670 | Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu). |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fischer | K1691 | Used for reverse transcription of mRNA into cDNA synthesis. Kit includes Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript. |
| Pefect size 1Kb ladder | 5 Prime | 2500360 | Molecular weight DNA ladder. |
| Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III | Alpha Innotech | Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel. | |
| Low Molecular Weight Ladder | New England BioLabs | N3233L | Molecular weight DNA ladder. |
| Vortex Mixer | MidSci | VM-3200 | |
| Mini Centrifuge | MidSci | C1008-R | |
| Dry Bath | MidSci | DB-D1 | |
| NanoDrop 2000C | ThermoFisherScientific | ND-2000C | Spectrophotometer. |
| Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | BioRad | 1704469 | Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | Power supply for gel electrophoresis. |
| Agarose | Dot Scientific | AGLE-500 | |
| Mastercycler Gradient | Eppendorf | 950000015 | PCR thermocycler. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli cells | ThermoFisherScientific | K280020 | |
| MyPCR Preparation Station Mystaire | MidSci | MY-PCR24 | Hood dedicated to PCR work. |
| Hamilton SafeAire II fume hood | ThermoFisherScientific | Fume hood. | |
| Beckman Coulter Z1 Particle Counter | Beckman Coulter | 6605698 | Particle counter. For counting cells before plating for RNA extraction. |
| Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 | Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) | Software to analyze Sanger sequencing data. |
Referências
- Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3′ end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
- Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
- Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
- Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
- Bertioli, D., White, B. A. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).
- Freeman, L. A., Freeman, L. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5′ and 3′ RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).
- Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
- Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
- Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
- International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
- Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
- Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
- Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
- Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).
