Anpassa 3' slutar snabb förstärkning av CDNA för att mappa avskrifter i Cancer

Summary

Två olika 3′ snabb förstärkning av cDNA ändar (3′ RACE) protokoll beskrivs här gör användning av två olika DNA-polymerases mappa sekvenser som innehåller ett segment av ramen öppen läsning (ORF), den stop kodon och den hela 3′ UTR av en avskrift som använder RNA erhållits från annan cancer cellinjer.

Abstract

Mognaden av eukaryota mRNA innebär 3′ slutet-formationen, vilken innebär tillägg av en poly(A) svans. För att kartlägga 3′ ände en gen, är den traditionella metoden för val 3′ snabb förstärkning av cDNA slutar (3′ RACE). Protokoll för 3′ RACE kräver noggrann design och urval av kapslade primers inom 3′ oöversatta regionen (3′ UTR) av målgenen sevärdheter. Men, med några ändringar i protokollet kan användas till att omfatta hela 3′ UTR och sekvenser inom ramen öppen läsning (ORF), som ger en mer heltäckande bild av förhållandet mellan ORF och den 3′ UTR. Detta är förutom identifiering av polyadenylation signalen (PAS), liksom webbplatsen klyvning och polyadenylation som tillhandahålls av konventionella 3′ RACE. Utökad 3′ RACE kan upptäcka ovanliga 3′ utr, inklusive genfusioner inom den 3′ UTR, och sekvens informationen kan användas för att förutsäga potentiella miRNA bindningsställen samt AU rika destabiliserande element som kan påverka stabiliteten i avskriften.

Introduction

Bildandet av slutet 3′ är ett kritiskt steg i mRNA mognad som består av klyvning av pre-mRNA nedströms av en PAS följt av tillägg av ~ 250 untemplated adenines, som gör upp poly(A) svans^1,2. Poly(A) bindande proteinet (PABP) binder till poly(A) svansen, och detta skyddar mRNA avskriften från nedbrytning och underlättar översättning¹.

Aktuella beräkningar föreslår att 70% av mänskliga gener har flera PASs, och således genomgå alternativa polyadenylation, vilket resulterar i flera 3′ slutar³. Det är därför viktigt att identifiera där poly(A) svansen fäster till resten av de 3′ UTR, samt identifiera PAS används av någon viss avskrift. Tillkomsten av nästa generations sekvensering har resulterat i samtidig identifiering av de 3′ utr och passera av tusentals gener. Denna ökning av sekvensering kapacitet krävs utveckling av bioinformatiska algoritmer att analysera data som rör alternativa polyadenylation av 3′ slutet. För de novo detektering eller validering av PAS och därmed kartlägga 3′ ände enskilda gener från storskalig sekvensering data, återstår 3′ RACE metoden för val^4,5. De sekvenser som ingår i cDNA produkter av 3′ RACE normalt omfatta endast en del av de 3′ UTR som innehåller poly(A) svansen, webbplatsen klyvning, PAS och sekvenserna uppströms av PAS. Till skillnad från PCR, som kräver utformningen och användningen av genen specifika framåt och bakåt grundfärger, kräver 3′ RACE endast två gen specifika kapslade framåt primers. PCR kräver därför en mer detaljerad kunskap om av nukleotidsekvensen i en stor region av genen förstärkt^4,6. Eftersom 3′ RACE använder reverse samma primer att mål poly(A) svans för alla polyadenylated RNA avskrifter, endast framåt primers behöver vara gen specifika, således, som endast kräver kunskap om ett betydligt mindre område av mRNA. Detta gör det möjligt för förstärkning av regioner vars sekvenser inte är fullständigt karakteriserad^4,7. Detta har gjort minst 3′ RACE att användas inte bara att avgöra 3′ ände en gen, men att också fastställa och karakterisera stora regioner uppströms i PAS som utgör en betydande del av de 3′ UTR. Genom att kombinera 5′ RACE med den modifierade 3′ RACE som innehåller större portionr av de 3′ UTR och flankera regioner, är det möjligt att helt sekvens eller klona en hela mRNA avskrift från slutet 5′ till dess 3′ slutet⁸.

Ett exempel på denna tillämpning av ändrade 3′ RACE är senaste identifiering av en roman CCND1-MRCK fusion gen avskrift från mantelcellslymfom cellinjer och cancerpatienter. Den 3′ UTR bestod av sekvenser från både CCND1 och MRCK gener och var motsträviga till miRNA förordning⁹. Två kapslade CCND1 specifika framåt primers kompletterade i regionen omedelbart angränsande och nedströms den CCND1 stop kodon. Även om hela transkriptom sekvensering tillsammans med specifika bioinformatiska verktyg kan användas för att upptäcka genfusioner inom de 3′ UTR¹⁰, många laboratorier kan saknar ekonomiska resurser eller bioinformatiska expertis för att göra användningen av denna teknik. Därför är 3′ RACE ett alternativ för de novo identifiering och validering av nya fusion gener som involverar den 3′ UTR. Med tanke på den drastiska ökning av antalet rapporterade fusion gener samt Läs igenom avskrifter, blivit 3′ RACE ett kraftfullt verktyg i kännetecknar gen sekvenser^11,12. Nya studier har dessutom visat att olika sekvenser inom den 3′ UTR samt längden på den 3′ UTR kan påverka mRNA avskrift stabilitet, lokalisering, översättbarhet och funktion¹³. Beror delvis på ett ökat intresse i kartläggning av transkriptom, har det skett en ökning av antalet olika DNA-polymerases utvecklas för användning i labbet. Det är viktigt att bestämma vilka typer av ändringar kan göras till 3na ‘ RACE protokoll i syfte för att utnyttja den tillgängliga repertoaren av DNA-polymerases.

Detta arbete rapporter anpassning 3′ RACE att mappa den hela 3′ UTR, PAS, och 3′ slutet klyvning platsen av ANKHD1 utskriften med hjälp av kapslade grundfärger i avsnittet ANKHD1 i avskriften och två olika DNA-polymerases.

Protocol

Bära en labbrock, handskar och skyddsglasögon vid alla gånger medan du utför alla procedurer i detta protokoll. Se till att behållare/rör som innehåller fenol och guanidin isotiocyanat reagensen bara öppnas i en certifierad huva och kassera fenol avfall i en utsedda behållare. Använda DNAS/RNAse-free sterila tuber, tips och reagenser. 1. cell kultur Växa i HeLa cellen fodrar och två suspension mantle cell lymfom cellinjer, Granta-519 och Jeko-1, i DMEM innehållande 10% F…

Representative Results

Kapslade framåt Primer Sök: Agarosgel från Figur 1 visar två distinkta PCR gel produkter (körfält 1 och 2) som använder samma vidarebefordra primer men olika omvänd grundfärger. Lane 3 har en distinkt PCR-produkt och har en distinkt framåt och bakåt primer. Perfekt primers för PCR-baserade reaktionen är de som ger en distinkt PCR-produkt (Lane 3). Forward primer används i…

Discussion

Trots tillkomsten av massiva parallella sekvensering teknik, på grundval av gen-av-Gen 3′ RACE är fortfarande den enklaste och mest ekonomiska metoden att identifiera PAS och nukleotider intill poly(A) svansen. Anpassning beskrivs här expanderar med 3′ RACE att både förstärka och karta sekvenser som inkluderar en del av ORFEN, den stop kodon och den hela 3′ UTR av ANKHD1 mRNA utskriften. En stor fördel med 3′ RACE är att produkter från 3′ RACE med några smärre anpassningar, kan klonas till andra vekto…

Materials

HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.