Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Summary

Dit artikel beschrijft een methode voor het analyseren van immuun celinhoud van adipeus weefsel door isolatie van immuuncellen uit vetweefsel en latere analyse met behulp van stroom cytometry.

Abstract

Infiltratie van immuuncellen in de subcutane en viscerale adipeus weefsel (AT) deposito’s leidt tot een low-grade ontsteking bij te dragen tot de ontwikkeling van obesitas-geassocieerde complicaties, zoals diabetes type 2. Kwantitatief en kwalitatief onderzoek doen naar de immuun cel subsets in mens op deposito’s, hebben wij een stroom cytometry aanpak ontwikkeld. De stromale vasculaire noemer (SVF), met de immuun cellen, is geïsoleerd van subcutane en viscerale op biopsieën door collagenase spijsvertering. Adipocytes worden verwijderd na het centrifugeren. De cellen van SVF zijn gekleurd voor meerdere membraan-gebonden markeringen geselecteerd om te differentiëren tussen immuun cel subsets en geanalyseerd met behulp van stroom cytometry. Als gevolg van deze aanpak, pro – en anti – inflammatory macrofaag deelverzamelingen, dendritische cellen (DC’s), B-cellen, CD4⁺ en CD8⁺ T-cellen en NK-cellen kunnen worden gedetecteerd en kan worden gekwantificeerd. Deze methode geeft gedetailleerde informatie over immuuncellen in AT en het bedrag van elke specifieke deelverzameling. Aangezien er talrijke fluorescerende antilichamen beschikbaar, kan onze stroom cytometry aanpak worden aangepast voor het meten van verschillende andere cellulaire en intracellulaire markeringen van belang.

Introduction

Obesitas wordt gekenmerkt met low-grade AT ontsteking¹ en infiltratie van pro-inflammatoire immuuncellen in zowel viscerale en onderhuidse op (BTW, zat). Accumulatie van pro-inflammatoire immuuncellen in de BTW leidt tot insulineresistentie die een primaire risicofactor is voor het ontwikkelen van type 2 diabetes². Immune cellen van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem zijn te vinden in de zwaarlijvige AT, zoals macrofagen, mestcellen, neutrofielen, CD4⁺ en CD8⁺ T-cellen en B-cellen^{3,4,5,6 ,7}. Deze immuuncellen, samen met de endotheliale cellen, stromale cellen adipocyte progenitorcellen, fibroblasten en pericytes, vormen de SVF⁸ en zijn de belangrijkste bron van pro-inflammatoire stoffen in de AT-⁹.

De inflammatoire status van AT wordt vaak onderzocht door technieken en westelijke vlek¹⁰, qPCR¹¹, immunohistochemistry¹¹. Echter bij het gebruik van deze technieken, de gehele AT adipocytes en SVF, wordt gebruikt. Dit maakt het moeilijk om te bepalen van het bedrag en de deelverzamelingen van immune cellen aanwezig in de AT. Immune cellen hebben verschillende cel markeringen te definiëren en te categoriseren, zoals macrofagen. Macrofagen weergeven significante heterogeniteit in zowel de functie als de cel oppervlakte marker expressie¹². Daarom zijn ze vaak onderverdeeld in twee macrofaag populaties: M1 en M2. M2 macrofagen worden meestal genoemd als alternatief geactiveerde macrofagen^12,13 en wonen in het AT van mager, metabolisch normale mensen¹⁴. Echter, tijdens obesitas, een fenotypische switch komt uit M2 macrofagen M1 macrofagen. Deze klassiek M1 macrofagen express CD11C¹² en accumuleren rond dood adipocytes om te vormen van de kroon-achtige structuren¹³geactiveerd. Het is aangetoond dat CD11C⁺ macrofagen in de AT aantasten insuline actie en zijn geassocieerd met insulineresistentie in zwaarlijvige mensen¹⁵. Als u wilt identificeren M1 en M2 macrofagen in de AT, is immunohistochemistry een optie. Deze techniek geeft informatie over de locatie van de macrofagen in de weefsels. Echter zal het beperken van het aantal markeringen die kan worden gebruikt in een kleuring. Bovendien, het is ook moeilijk te kwantificeren. Daarom, om te onderzoeken de verschillende immuun cel subsets in de BTW- en zat deposito’s, hebben wij een stroom cytometry aanpak ontwikkeld. Deze aanpak geeft ons de mogelijkheid om meerdere markers per cel met één stroom cytometry analyse gebruiken voor het definiëren van cel subsets en tellen van het aantal elke deelverzameling aanwezig in de AT-deposito’s.

Protocol

Viscerale en onderhuidse op monsters werden genomen uit de onderwerpen die zijn ingeschreven in de studie goedgekeurd door de medisch-ethische commissie Jessa ziekenhuis, Hasselt en Universiteit Hasselt (België), overeenkomstig de verklaring van Helsinki. 1. bereiding van reagentia Collagenase oplossing Los 1 g van Collagenase ik in 10 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, zonder calcium en magnesium) te maken van een stamoplossing van 100 mg/mL. Bereiden van 200 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C. Los 1 g Collagenase XI in 10 mL PBS te maken van een stamoplossing van 100 mg/mL. Bereiden van 200 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C. Los 10 mg DNase ik in 10 mL PBS te maken van een stamoplossing van 10 mg/mL. Bereiden van 180 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C. Voeg 100 µL Collagenase I (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) en 90 µL DNase I (10 mg/mL) tot en met 10 mL van de DMEM Ham F12. Maak collagenase oplossing vers voor elke isolatie. Erytrocyt lysis-buffermengsel Ontbinden 0.84 g NH4Cl in 100 mL ultrazuiver water. De pH vastgesteldop 7.4 vóór gebruik. Opslaan in een maatkolf van glas bij 4 ° C. Plaats de erytrocyt lysis-buffermengsel op ijs vóór gebruik. FACS buffer Los 0,5 g bovien serumalbumine (BSA) in 100 mL PBS te verkrijgen van 0,5% BSA PBS. Los 65 mg NaN3 in 100 mL 0,5% BSA PBS te verkrijgen van 10 mM NaN3 0,5% BSA PBS. Winkel oplossing in een maatkolf van glas bij 4 ° C. Plaats FACS buffer op ijs vóór gebruik.Let op: NaN3 is zeer giftig. Werken in een zuurkast en Draag veiligheidsbril en handschoenen voor bescherming tijdens het verwerken van NaN3. Menselijke IgG blok Los 10 mg van menselijke IgG in 10 mL PBS te verkrijgen van 1 mg/mL. Bereiden van 100 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C. Plaats het menselijke IgG-blok op ijs vóór gebruik. 2. isolatie van SVF van AT 1 g bij biopsie in kleine stukjes gesneden (± 2 mm2) met een scalpel en overdracht aan een 50 mL centrifugebuis (b.v., Falcon buis). Voeg 10 mL van collagenase oplossing aan elk op monster.Opmerking: Sluit het deksel van de buis volledig en draaien het deksel ¼ terug. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C in een waterbad onder zacht schudden (60 cycli/min). De resulterende schorsing filteren met een 200 µM filter en het verzamelen van het monster in een nieuwe centrifugebuis van 50 mL. Voeg 7 mL PBS op de top van het filter te spoelen van het filter en het verkrijgen van alle cellen. Centrifugeer het monster bij 280 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder de zwevende adipocyte breuk door pipetteren. De cel pellet is de SVF.Opmerking: Verwijder de adipocyte-Fractie om te verkrijgen van SVF. Vermijd dompelen de hele tip in de steekproef omdat dit alleen de PBS en niet de drijvende adipocytes verwijdert. Resuspendeer de SVF in 5 mL PBS te verwijderen collagenase, filter de opschorting met een 70 µM filter spoelen van het filter met 5 mL PBS en Centrifugeer het monster bij 280 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 mL erytrocyt lysis-buffermengsel. Incubeer gedurende 5 min op ijs. Voeg 7 mL PBS na incubatie. Centrifugeer het monster bij 280 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. 3. kleuring van SVF Stroom Cytometry p.a. Los van de cel pellet in 90 µL 4 ° C FACS buffer en voeg 10 µL van 1 mg/mL menselijke IgG blok. Verdeel de celsuspensie in 2 wells van een 96 v-vorm goed plaat. Plaats van de plaat op ijs en laat het menselijke IgG blok Incubeer gedurende 15 minuten. Voeg 100 µL FACS buffer aan elk monster te wassen en centrifugeren van de plaat voor 5 min met 280 x g bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof door het kantelen van de plaat ondersteboven in één vloeiende beweging zonder te tikken op de plaat.Opmerking: Zorg ervoor dat alle resterende vloeistof verwijderen vanaf de bovenkant van de plaat met een tissue terwijl de plaat ondersteboven te houden. Antilichaam cocktails voor macrophage en DC deelverzamelingen (FACS panel 1) en voorbereiden voor T – en B-cel subsets (FACS panel 2) zoals beschreven in tabel 1 en tabel 2. De volumes beschreven in tabel 1 en tabel 2 worden geselecteerd na het optimaliseren van de antilichaam-concentraties en voldoende zijn voor een BTW- of zat monster.Opmerking: In FACS panel 1, de markers, CD303 en CD141 gebruiken om te bevestigen dat CD11C+ CD11Blaag cellen zijn DCs. Het is echter raadzaam om uit te sluiten van deze markers van het deelvenster te nemen een leven/dood kleuring. Beide FACS paneel 1 en 2 kan worden gecombineerd met de levensvatbaarheid van de LIVE/DEAD Fixable Red Dead cel Stain Kit kleuring wanneer ongebruikte exclusief CD303 in deelvenster 1 als het PE-kanaal zal zijn. Uitvoeren van levensvatbaarheid kleuring volgens de instructies van de fabrikant. Resuspendeer de pellet in 29.5 µL antilichaam cocktail voor FACS paneel 1, en 23 µL antilichaam cocktail voor FACS panel 2. Incubeer gedurende 30 min. in het donker op het ijs. Voeg 150 µL FACS buffer aan elk putje en resuspendeer de pellet van de cel voor het uitvoeren van een tweede wassen stap. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten op 280 x g- en 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof door het kantelen van de plaat ondersteboven. Voeg 150 µL 1% formaldehyde oplossing aan elk putje te lossen van de cellen. De celsuspensie van elk putje overbrengen aan de overeenkomstige FACS buis door pipetteren met een pipet P200. Opslaan FACS buizen bij 4 ° C in het donker tot 7 dagen.Nota: Directe meting is ook mogelijk. 150 µL FACS buffer toevoegen aan elk putje in plaats van 1% formaldehyde, overdracht van de cellen door pipetteren met een pipet P200 aan de overeenkomstige FACS buizen en analyseren van de cellen.Let op: Formaldehyde is zeer giftig. Formaldehyde oplossingen voor te bereiden tijdens het werken in een zuurkast te voorkomen van inademing en draag handschoenen en veiligheidsbril voor bescherming. 4. Stroom Cytometry analyse Vóór de eerste meting, kunt een onbevlekt negatieve controle instellen de voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC). De spanningen van de stroom cytometer volgens de instructies van de fabrikant zodanig aanpassen dat alle populaties van belang zichtbaar in de FSC en SSC grafiek zijn en een onderscheid tussen het puin en levende cellen kan worden gemaakt. Multi kleur compensatie analyses uit te voeren met antilichaam vangen kralen volgens protocol van de fabrikant. Fluorescentie minus één (FMO) controles voor te bereiden door de mix van antilichaam maar uitsluiten van één antilichaam van de mix. Doe dit voor elke antilichaam, 8 antilichaam mixen voor FACS paneel 1 en 6 antilichaam mixen voor FACS panel 2 maken. Deze mixen FMO antilichaam worden gebruikt om vlekken van SVF zoals eerder is beschreven in dit protocol. Meet alle FMO besturingselementen en de gating strategie gebaseerd op FMO besturingselementen instellen. Gebruik de FMO-besturingselementen om te detecteren van mogelijke auto-fluorescentie van de cellen.Opmerking: Door het verwijderen van één antilichaam van de mix, elk niveau van de fluorescentie ontdekt in dit kanaal is een achtergrond/autofluorescent-signaal. Vandaar, door het vergelijken van de verschillende FMO controleresultaten FACS, poorten op specifieke populaties ervoor te zorgen dat de gatings zijn gebaseerd op positieve cellen en niet op basis van auto-fluorescentie kunnen worden getrokken. Vortex de FACS buizen bij 800 rpm alvorens hen te plaatsen in de cytometer van de stroom en begint de meting.Opmerking: Een minimum van 50.000 evenementen in de levende poort wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat voldoende cellen worden gemeten vanaf elke subpopulatie.

Representative Results

De SVF geïsoleerd van BTW en zat werd gemeten met behulp van stroom cytometry. Stroom cytometry metingen genereren percelen tonen verschillende cel populaties op basis van cellulaire markeringen (figuur 1A en 1B). Eerst, door het uitzetten van de voorwaartse verstrooien breedte (FSC-W) en toekomen scatter gebied (FSC-A), cel aggregaten kunnen worden geëlimineerd uit verdere analyse door de afzonderlijke cellen gating als lage FSC-W. Volgende, levende cellen zijn geselecteerd, en cellulaire puin wordt uitgesloten door de cellen van de juiste grootte en complexiteit met behulp van FSC gating-A en de zijde verstrooien gebied (WS-A), respectievelijk. Dode cellen zijn klein en dus zichtbaar als een aparte populatie met een kleine FSC-A. Volgende, immuun cellen werden geselecteerd door gebruik van de pan-leukocyte markering CD45 (paneel 1 en 2, figuur 1A). Voor het analyseren van macrofagen, andere immune cellen zoals T-cellen (CD3), B-cellen (CD19), neutrofiele granulocyten (CD66b+ CD11b+), en NK-cellen (CD56) werden uitgesloten van verdere analyse met behulp van verschillende antilichamen gericht op deze cellen, maar met dezelfde fluorescerende. Verdere onderverdeling van de resterende cellen was gebaseerd op CD11b en CD11c expressie. Dit resulteerde in de volgende populaties: CD11b+ CD11c+ macrofagen, CD11b+ CD11c- -macrofagen en CD11blaag /- CD11c+ DCs (FACS panel 1, figuur 1B). Meting van de gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI) toegestaan de kwantificering van de uitdrukking van CD303 (plasmacytoid DC marker) en CD141 (DC marker), op CD11b+ CD11c+ macrofagen en CD11blaag /- CD11c+ DCs. Expressie van deze beide markeerders waren hoger in CD11blaag /- CD11c+ cellen bevestigen dat CD11blaag /- CD11c+ cellen werden DCs (Figuur 1 c). De CD45+ cellen (figuur 1A) waren verdeeld in T-cellen en B-cellen met behulp van CD3 en CD19, respectievelijk. T-cellen werden onderverdeeld in T-helper cellen (CD4+) en cytotoxische T-cellen (CD8+). Tot slot, CD3-CD19-cellen werden getekend te kwantificeren van NK-cellen met behulp van de markering CD56 (FACS panel 2, Figuur 1 d). Het aantal cellen in elke poort wordt gekwantificeerd en kan worden gebruikt voor de berekening van het percentage van deze celtype van alle levende cellen (tabel 3). Het percentage van levende cellen kan worden berekend voor elk onderwerp, waardoor de berekening van een gemiddelde van alle onderwerpen in een groep van bijvoorbeeld mager of zwaarlijvige mannen worden getoond van de overvloed van een specifieke immuun cel, dat wil zeggen, de pro-inflammatoire CD11b+ CD11c+ macrophage in viscerale AT (Figuur 2). Figuur 1. FACS gating strategie van viscerale vetweefsel. (A) FACS plot van alle evenementen (zwart) met voorwaartse scatter breedte intensiteit (FSC-W) en voorwaartse scatter gebied intensiteit (FSC-A) die een poort Schakel alleen afzonderlijke cellen (rood) gevolgd door een perceel van FACS gebaseerd op FSC-A en zijde scatter gebied intensiteit (WS-A) die bevatten een selectie van levende cellen (lichtgroen) poort. Vervolgens plot met WS-A en CD45 fluorescentie intensiteit bevat een poort selecteren alle CD45+ (immuun) cellen (blauw). (B) FACS plot van CD19, CD3, CD66b en CD56 intensiteit van de fluorescentie versus CD11b fluorescentie intensiteit, en een poort selecteren alle cellen die CD19, CD3, CD66b en CD56 negatieve zijn (bruin) voor verdere opsplitsing in populaties. Verdere onderverdeling in de volgende plot op basis van CD11b en CD11c intensiteit van de fluorescentie. Poorten worden weergegeven met CD11b+ CD11c+ macrofagen (donkergroen), CD11b+ CD11c- macrofagen (paars), en CD11blaag /- CD11c+ dendritische cellen (blauw). (C) bedrag van CD11b+, CD11c+, of CD11blaag /- CD11c+ cellen (y-as) weer te geven van hun niveaus van intensiteit van de fluorescentie (x-as) voor CD303 en CD141 en de bijbehorende kwantificering van het gemiddelde de intensiteit van de fluorescentie (MFI’s). (D) FACS perceel weergeven van de eerdere CD45+ bevolking (blauw) gebaseerd op CD3 en CD19 fluorescentie intensiteit met poorten selecteren van T-cellen (magenta), B-cellen (donkergroen) en niet-autofluorescent cellen (groen) negatieve voor beide CD3 en CD19. Het volgende verhaal is gebaseerd op CD4 en CD8 fluorescentie met poorten selecteren CD4+ (lichtgroen) en CD8+ (magenta) T-cellen. Een identieke gating strategie wordt gebruikt voor onderhuidse vetweefsel. Een identieke gating strategie wordt gebruikt voor onderhuidse vetweefsel. Dit cijfer is gewijzigd van Wouters et al. 16 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2. Zwaarlijvige BTW bevat meer pro-inflammatoire macrofagen. De hoeveelheid CD11b+ CD11c+ macrofagen gepresenteerd als percentage van alle levende cellen in BTW van mager en zwaarlijvige mannen. Alle gegevens zijn middelen ± SEM; n = 20 voor lean en n = 31 voor zwaarlijvige. p ≤ 0.01 vs. mager. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Doel Definitie doel Presenteren op Fluorescerende Hoeveelheid Kloon CD11B myeloïde integrine marker Granulocyten, monocyten/macrofagen, dendritische cellenlage en natural killer cellen BV421 2.5 ΜL ICRF44 CD19 gemeenschappelijk antigeen van de B-cel B-cel ontwikkeling van pro-B cel tot blastoid-B-cel en plasma B-cel FITC 3 ΜL HIB19 CD3 gemeenschappelijke T cel antigeen T-lymfocyten, natuurlijke killer T cellen en thymocytes FITC 3 ΜL UCHT1 CD66B lid van het carcino-antigeen (CEA)-glycoproteïne familie graag Granulocyten FITC 5 ΜL G10F5 CD56 zwaar geglycosyleerde hechting eiwit Natural killer cellen en natuurlijke killer T cellen FITC 5 ΜL B159 CD303 type II transmembraan glycoproteïne plasmacytoid dendritische cellen PE 1 ΜL 201A CD141 thrombomodulin monocyten/macrofagenlage, subpopulatie van dendritische cellen APC 1 ΜL M80 CD11C Typ ik transmembraan glycoproteïne; integrine-αx dendritische cellen, Granulocyten, monocyten/macrofagen, natural killer cellen, deelverzameling van B- en T-cellen APC-Cy7 0,5 ΜL Bu15 CD45 gemeenschappelijke leukocyte antigeen alle menselijke leukocyten, met inbegrip van lymfocyten, monocyten, Granulocyten, eosinofielen en thymocytes PE-Cy7 1 ΜL HI30 FACS buffer – – – 7.5 µl – Tabel 1. Antilichaam cocktail voor FACS panel 1 te identificeren macrofaag deelverzamelingen en dendritische cellen populaties. Hoeveelheid antilichaam beschreven is voor de analyse van een monster. Doel Definitie doel Presenteren op Fluorescerende Hoeveelheid Kloon CD19 gemeenschappelijk antigeen van de B-cel B-cel ontwikkeling van pro-B cel tot blastoid-B-cel en plasma B-cel BV421 1 ΜL HIB19 CD3 gemeenschappelijke T cel antigeen T-lymfocyten, natuurlijke killer T cellen en thymocytes V500 3 ΜL UCHT1 CD56 zwaar geglycosyleerde hechting eiwit Natural killer cellen en natuurlijke killer T cellen APC 5 ΜL HCD56 CD4 IG superfamilie, typ ik transmembraan glycoproteïne T helper cel, thymocytes, monocyten/macrofagen, type II natuurlijke killer T cellen PerCP-Cy5.5 1 ΜL RPA-T4 CD8 Α-subunit van een bisulfide-verbonden bimolecular complex cytotoxische T-cellen, thymocytes, subset van natural killer cellen APC-H7 2 ΜL SK1 CD45 gemeenschappelijke leukocyte antigeen alle menselijke leukocyten, met inbegrip van lymfocyten, monocyten, Granulocyten, eosinofielen en thymocytes PE-Cy7 1 ΜL HI30 FACS buffer – – – 10 µl – Tabel 2. Antilichaam cocktail voor FACS deelvenster 2T – en B-cel populaties identificeren. Hoeveelheid antilichaam beschreven is voor de analyse van een monster. Macrophage paneel De naam van de poort # Cellen % van live Afzonderlijke cellen 183054 Live 10477 100 CD45 4100 39.13 dump- 771 7.36 CD11C- CD11B+ 430 4.1 CD11C+ CD11B+ 104 0.99 CD11C+ CD11Blaag /- 15 0.14 T-cel, B-cellen, NK-cel paneel De naam van de poort #Cells % van live Afzonderlijke cellen 34616 Live 3728 100 CD45+ 1589 42.62 NK-cellen 29 0.78 CD3+ 953 25.56 CD4+ 601 16.12 CD8+ 328 8.8 CD19+ 20 0.54 Tabel 3. Immuun cel overvloed van verschillende celtypes in BTW. Aantal cellen in elke poort en het percentage van de verschillende soorten cellen op basis van het totale bedrag van levende cellen.

Discussion

Deze methoden wordt beschreven hoe om te isoleren van de FØROYA van BTW en zat en kwantificeren van de relatieve hoeveelheden van immune cellen binnen deze weefsels. Bovendien staat de methoden het bepalen van de expressie van merkers op specifieke celtypes.

Stroom cytometry van weefsel immune cellen is een krachtige techniek om fenotype de immunologische toestand van weefsels. De kwantificering van weefsel immune cellen hebben vele toepassingen. Zoals beschreven in de resultaten, is het mogelijk om te vergelijken van de aanwezigheid van bepaalde immuuncellen tussen groepen van patiënten (b.v.mager vs. zwaarlijvige). Daarnaast door te voeren ook stroom cytometry op bloed van de dezelfde patiënten, kunnen associaties tussen circulerende cellen en weefselcellen worden onderzocht. Met deze toepassing konden wij vaststellen dat een specifieke subset van circulerende monocyten gekoppeld van pro-inflammatoire CD11C is⁺ adipeus weefsel macrofagen¹⁶.

Aanpassingen van het protocol beschreven zal haar toepassingen uitbreiden naarmate talrijke beschikbare fluorescerende antilichamen stroom cytometry zeer veelzijdig maken. Met verschillende antilichamen bijna alle celtypes kunnen worden onderscheiden en de uitdrukking van veel markers kan worden gedetecteerd. Daarnaast is het mogelijk om markeringen intracellulair vlek door het permeabilizing van de celmembraan zodat de intracellulaire binding van de fluorescerende antilichamen. Deze kenmerken kunnen onderscheid van de zeer uiteenlopende macrofaag bevolking buiten de overdreven vereenvoudigde M1 en M2 macrofaag subtypen. Naast meting van oppervlakte marker expressie, kunnen eiwitten (d.w.z., cytokines) worden gekleurd intracellulair voorlichting over macrofaag functionaliteit. Daarnaast worden proliferatie markeringen zoals Ki67 gebruikt voor het kwantificeren van proliferatie tarieven. Zoals beschreven, was onderscheid tussen macrofagen en DCs gebaseerd op MFI niveaus van DC markers. Een algemene macrofaag-marker, zoals CD68 kan worden opgenomen in de macrofaag deelvenster (FACS deelvenster 1). CD68 moet echter worden gekleurd intracellulair vereisen permeabilization van de celmembraan die niet beter en zou verlenging van het protocol. Andere macrofaag markers zijn deelverzameling markeringen zoals CD163 en CD206 of CD11c, de laatste wordt geïntegreerd in het deelvenster van de macrofaag hier gepresenteerd.

In onze FACS panelen, een marker te onderscheiden van levende en dode cellen werd niet opgenomen, die zou wenselijk zijn omdat hierdoor een nauwkeuriger uitsluiting van dode cellen dan het gebruik van FSC en WS. Vaak gebruikt zijn de DNA kleuring levensvatbaarheid kleurstoffen propidium jodide (PI) of 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), evenals gratis amine reageren kleurstoffen zoals de LIVE/DEAD Fixable dode cel Stain Kit, die beschikbaar is in verschillende kleurstof kleuren. Nochtans, PI en DAPI niet worden gebruikt bij de vaststelling van de cellen. Zoals beschreven in het protocol, kan de kleuring van de levensvatbaarheid van de LIVE/DEAD Fixable Red Dead cel worden geïntegreerd in beide panelen zonder de algehele FACS gating strategie.

Bovendien, worden de gegevens uitgedrukt als een percentage van levende cellen wat betekent dat alle gegevens zijn relatief. Alleen door het invoeren van een exacte, zou bekend aantal cellen in de stroom cytometer, het mogelijk om te bepalen van het exacte aantal elk celtype. Een geschatte aantal cellen kon worden berekend na het tellen van de cellen in de Fractie SVF met behulp van een tellen kamer. Dit aantal zou moeten worden aangepast voor de hoeveelheid biopsie weefsel gebruikt om te isoleren van de FØROYA, maar dit heeft beperkingen bij het vergelijken van mager tot zwaarlijvige op. Een soortgelijke massa van zwaarlijvige AT bestaat uit minder adipocytes zoals ze zijn gevuld met lipiden en aanzienlijk hebben uitgebreid. Dit kan leiden tot een onderschatting van immuun celaantal als aantal immuuncellen per gram op of per adipocyte.

In menselijke studies, wordt opneming van patiënten meestal gedaan over een langere periode van tijd, waardoor standaardisatie van experimentele procedures van groot belang. Voor vergelijking van stroom cytometry gegevens tussen patiënten zijn er verschillende opties. Zoals beschreven in dit protocol, kunnen cellen vóór de meting waardoor analyse van verschillende monsters op dezelfde dag worden vastgesteld. Dit kan ook worden bereikt door bevriezing van de FØROYA voordat kleuring hen, waardoor de kleuring procedure gelijk is tussen alle monsters, maar de levensvatbaarheid van de cellen kan worden beïnvloed. Tot slot, ook werkzaam in deze studie, zijn fluorescerende kralen installeren compensatie niveaus en cytometer bijhouden kralen bi-wekelijkse werden gebruikt voor het standaardiseren van dagelijkse metingen van de cytometer. Deze laatste optie is het meest efficiënt wanneer het meten van monsters uit een studie die verspreid over een lange periode van tijd.

Een beperkende factor voor stroom cytometry is in het algemeen het gebruik van fluorescentie. Het aantal fluorescerende etiketten die gelijktijdig kunnen worden ontdekt is beperkt als gevolg van overlapping in emissie spectra. Echter met slimme FACS deelvenster ontwikkeling en het gebruik van verschillende antilichaam cocktails per BTW- of zat monster, kan dit probleem worden opgelost zoals beschreven in dit protocol. Een belangrijk aspect van FACS deelvenster ontwikkeling is FMO besturingselementen. Met behulp van alle antilichamen van het deelvenster met uitzondering van één, kunnen de potentiële autofluorescence niveaus worden gewaardeerd bij het vergelijken van de FMO met het volledige deelvenster. Hierdoor is nauwkeurige gating van populaties en deze procedures moeten worden uitgevoerd bij het opzetten van een nieuw FACS paneel. Bovendien kunnen nieuwe generaties van FACS apparaten detecteren maximaal 50 parameters waardoor gelijktijdige detectie van vele kenmerken per cel. Een andere kwestie met betrekking tot het aspect van de fluorescentie is de autofluorescence van cellen, met name in macrofagen. Na excitatie van de cellen met de laser FACS (voornamelijk met 488 nm golflengte excitatie), deze cellen een fluorescent signaal uitstoten (voornamelijk < 640 nm) dat kan overlapping met de spectra van de emissie van het antilichaam labels^17,18. Om dit te verklaren, moeten onbevlekt cellen worden gemeten om te bepalen van de autofluorescence in elk kanaal. Met deze kennis, moeten fluorochromes worden geselecteerd die een signaalsterkte die hoger is dan het signaal van de autofluorescent worden weergegeven. Dit autofluorescent achtergrond signaal moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de gating strategie van de bevolking. Dus, door toepassing van dit protocol en de intelligente FACS deelvenster ontwerp kan in diepte fenotype macrofaag subtypen. Nieuwe verschillende AT macrofagen en hun functie kunnen worden gekarakteriseerd.

Materials

Centrifuge	Hettich Rotanta 460R	5660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12	Gibco ThermoFisher	31330-095
Collagenase XI from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657-1g
Collagenase I from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C0130-1g
DNAse I from bovine pancreas	Sigma Aldrich	DN25
NH4Cl	Merck	1.01145.0500
Bovine Serum Albumine	Sigma Aldrich	A4503-100
NaN3	Merck	1.06688.0100
200 µM syringe Filcons	BD Biosciences	340613
70 µM filter	Greiner Bio-one	542070
Fc block / human IgG	Sigma Aldrich	14506
Formaldehyde	Merck	1.04003.2500
CD11b-BV421	Biolegend	301324
CD19-Fitc	BD Biosciences	555412
CD3-Fitc	BD Biosciences	561807
CD66b-Fitc	BD Biosciences	555724
CD56-Fitc	BD Biosciences	562794
CD11c-APC-Cy7	Biolegend	337218
CD45-PE-Cy7	BD Biosciences	557748
CD19-BV421	Biolegend	302234
CD3-V500	BD Biosciences	561416
CD56-APC	Biolegend	318310
CD4-PerCP-Cy5.5	Biolegend	300528
CD8-APC-H7	BD Biosciences	641400
CD303-PE	Biolegend	354204
CD141-APC	Biolegend	344106
FACS-Canto II	BD Biosciences
96 v-shape well plate	Greiner Bio-one	651101
PBS PH 7.4	Gibco ThermoFisher	10010023
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube	Corning	352052
IgG from human serum	Sigma Aldrich	I4506
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD Biosciences	552844
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD Biosciences	552843
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L23102
IKA MS 3 basic shaker	Sigma Aldrich	Z645028-1EA