השרשה שתלי כלי הדם Electrospun עם אופטימיזציה מבנה במודל חולדה
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה electrospinning ששונה כדי להמציא PCL שתלי כלי הדם עם נקבוביות גדולות וסיבים עבים, לתאר את פרוטוקול כדי להעריך את הביצועים ויוו במודל של עכברים של החלפת העורק הראשי.
Abstract
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק macroporous PCL שתל וסקולרית. ומתארות פרוטוקול הערכה באמצעות מודל עכברוש של החלפת העורק הראשי. השתלים כלי הדם electrospun לעיתים קרובות בעלי נקבוביות קטנות יחסית, אשר להגביל חדירה לתא השתלים ומעכבים את ההתחדשות ובניה של הניאו-העורקים. במחקר זה, PCL שתלי כלי הדם עם סיבי עבה יותר (5-6 מיקרומטר), נקבוביות גדולות יותר (~ 30 מיקרומטר) היו מפוברק באמצעות טכניקה לעיבוד ששונה. ביצועים לטווח ארוך של השתל הוערך על ידי ההשרשה במודל חולדה. העורק הראשי. אולטראסאונד הראה כי השתלים נותר פטנט ללא מפרצת או היצרות המתרחשים גם לאחר 12 חודשים של השרשה. Macroporous מבנה משופרת של ingrowth תא וקידם ובכך רקמות מחדש בגיל 3 חודשים. חשוב מכך, לא היה סימן של שיפוץ תופעות לוואי, כגון הסתיידות בתוך הקיר שתל לאחר 12 חודשים. לכן, electrospun PCL שתלי כלי דם עם macroporous ששונה עיבוד החזק פוטנציאל להיות תחליף עורק להשתלה לטווח ארוך.
Introduction
שתלי כלי הדם מחומרים פולימרים סינתטיים מנוצלים נרחב במרפאה לטיפול במחלות לב וכלי דם (CVDs). למרבה הצער, במקרה של השתלים דם בקוטר קטן (D < 6 מ מ) יש מוצרים מוצלחים זמינים עקב נמוך patency מופעלות על ידי מהירות זרימת דם מופחתת, אשר מובילה לעיתים קרובות פקקת, היפרפלזיה intimal, ועוד סיבוכים1.
הנדסת רקמות מספק אסטרטגיית חלופיים כדי להבין patency לטווח ארוך, הומאוסטזיס מבוסס על התחדשות נימי הדם מונחה לגרדום שחזור. בפירוט, השתל וסקולרית, כתבנית תלת מימדי, יכול לספק תמיכה מכנית והדרכה מבניים במהלך לרגנרציה של רקמות עילאיים ועל ההשפעה פונקציות הסלולר, כולל תא אדהזיה, הגירה, התפשטות, ו הפרשת מטריצה חוץ-תאית2. עד עכשיו, פולימרים סינתטיים שונים תאימותם ליישומים בהנדסת רקמות עילאיים. בין אלה פולימרים, poly(ε-caprolactone) (PCL) נחקר באינטנסיביות עקב תא טוב תאימות והשפלה איטי שנעו בין כמה חודשים עד שנתיים3. בעכברוש העורקים מודל4,5,6, שתלי כלי הדם PCL שעובדו על-ידי electrospinning הציג המבנית מעולה, patency, עלייה מתמדת כמו גם תא הפלישה, כורוידאלית ב שתל קיר עד 6 חודשים. עם זאת, רקמות לוואי שיפוץ, כולל רגרסיה של תאים, נימים, הסתיידות, גם נצפו ב timepoints יותר, עד ל-18 חודשי.
Cellularization של כלי הדם השתל היא גורם מפתח בקביעת התחדשות רקמות, ותתמוך7. Electrospinning, כמו טכניקה רב-תכליתי, כבר נרחב מועסקים עבור הכנת שתלי כלי הדם עם מבנה סיבי ננו8. למרבה הצער, המבנה הנקבובית קטן יחסית מובילה לעיתים קרובות לא מספיקות תא בחדירת השתל electrospun כלי דם, אשר מגביל את התחדשות רקמות עוקבות. כדי לפתור בעיה זו, טכניקות שונות נוסו כדי להגדיל את גודל הנקבוביות נקבוביות הכוללת, לרבות המלח/הפולימר שטיפת9,10, שינוי של אספן המנגנון, שלאחר הטיפול על ידי קרינת לייזר11 , ועוד. למעשה, המבנה של שתלי electrospun (כולל סיבים בקוטר גודל הנקבוביות, נקבוביות) קשורה קשר הדוק עיבוד התנאים12,13. במהלך electrospinning, קוטר סיבים ניתן לשלוט בקלות על-ידי שינוי הפרמטרים, כגון הריכוז של פולימר פתרון, קצב הזרימה, מתח, וכו ‘. 14 , 15, ו. לכן, גודל הנקבוביות ואת נקבוביות שופרו בהתאם.
לאחרונה דיווחנו PCL ששונה electrospun שתל למבנה macroporous (סיבי עם קוטר של 5-7 מיקרומטר, הנקבוביות של 30-40 µm). In vivo השרשה על-ידי החלפת עכברוש. העורק הראו שיעור גבוה של patency, כמו גם התחדשות endothelialization, שריר חלק טוב בגיל 3 חודשים לאחר הניתוח16. וחשוב מכך, אין תופעות לוואי רקמות כולל רגרסיה הסתיידות והתא יכול להיות שנצפו גם לאחר שנה אחת של השרשה.
Protocol
Representative Results
Discussion
חדירה לתא הוא קריטי עבור ההתחדשות, שיפוץ של שתל וסקולרית ויוו16. חדירה לתא מוגבל קשורה לעיתים קרובות הנקבוביות קטן יחסית של השתל המעכבים את ההעברה של תאים לתוך הקיר שתל. כדי לטפל הקושי הזה, פיתחנו שיטה שונה להכין electrospun PCL שתלי כלי הדם עם מבנה גדול שם. בפירוט, גודל הנקבוביות ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקטים NSFC (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 ו- 81401534).
Materials
| Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
| Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
| Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
| Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
| Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
| Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
| Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
| Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
| Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
| Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
| Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
| Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
| Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
| Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
| 5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
| Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
| Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
Referências
- Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation. J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).
- Zhang, L., et al. A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).
- Thottappillil, N., Nair, P. D. Scaffolds in vascular regeneration: current status. Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).
- Pektok, E., et al. Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation. Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).
- Innocente, F., et al. Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation?. Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).
- de Valence, S., et al. Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration. Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).
- Assmann, A., et al. Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating. Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).
- Baker, B. M., et al. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).
- Wang, K., et al. Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).
- Lee, B. L. P., et al. Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds. Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).
- Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. Increasing the pore size of electrospun scaffolds. Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).
- Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review. Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Rnjak-Kovacina, J., et al. Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering. Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).
- Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
