Implantation av Electrospun vaskulär grafter med optimerad struktur i en råtta modell
Summary
Här presenterar vi en modifierad electrospinning metod för att fabricera PCL vaskulär grafter med tjocka fibrer och stora porer och beskriva ett protokoll för att utvärdera i vivo i en råtta modell av bukaorta ersättare.
Abstract
Här presenterar vi ett protokoll för att fabricera avdunsta PCL vaskulär transplantat och beskriva en utvärdering-protokollet med hjälp av en råtta modell av bukaorta ersättare. Electrospun vaskulär grafterna äger ofta relativt små porer, som begränsa cell infiltration i grafterna och hindra regenerering och ombyggnad av neo-artärerna. I denna studie, var PCL vaskulär grafter med tjockare fibrer (5-6 µm) och större porer (~ 30 µm) fabricerade med hjälp av en modifierad bearbetningsteknik. Den långsiktiga resultat av graften utvärderades av implantation i en råtta bukaorta modell. Ultraljud undersökning visade att grafterna förblev patent utan aneurysm eller stenos uppstår även efter 12 månader efter implantation. Avdunsta struktur förbättras den cell inväxt och således främjas vävnad återskapas på 3 månader. Viktigare, fanns det inga tecken på negativa remodeling, såsom förkalkning inom kneg väggen efter 12 månader. Därför har electrospun PCL vaskulär grafter med modifierade avdunsta bearbetning potential att vara en artär substitut för långsiktig implantation.
Introduction
Vaskulär ympkvistar tillverkad av syntetiska polymerer utnyttjas ofta i klinik för behandling av hjärt-kärlsjukdomar (hjärtklaffarna). Tyvärr för liten diameter vaskulär transplantat (D < 6 mm) finns det inga framgångsrika produkter tillgängliga på grund av den låga patency utlöses av minskad blod flödeshastighet, vilket ofta leder till Trombos, intimans hyperplasi och andra komplikationer1.
Vävnadsteknik erbjuder en alternativ strategi för att förverkliga långsiktiga patency och homeostas baserat på en byggnadsställning-guidad vaskulär förnyelse och återuppbyggnad. I detalj, vaskulär transplantat, som en tredimensionell mall, kunde ge mekaniskt stöd och strukturella vägledning under regenerering av kärlvävnad och inflytande cellulära funktioner, inklusive celladhesion, migration, spridning, och utsöndringen av extracellulärmatrix2. Hittills har har olika syntetiska polymerer utvärderats för applikationer i kärlvävnad engineering. Bland dessa polymerer, har poly(ε-caprolactone) (PCL) undersökts intensivt på grund av bra cell kompatibilitet och långsam nedbrytning alltifrån flera månader till två år3. I en råtta aorta modell4,5,6, PCL vaskulär ympkvistar behandlas av electrospinning uppvisade utmärkt strukturell integritet och patency, samt som kontinuerligt ökad cell invasion och kärlnybildning i den transplantat vägg för upp till 6 månader. Dock negativa vävnad remodeling, inklusive regression av celler och kapillärer och förkalkning, observerades också vid längre tidpunkter, upp till 18 månader.
Cellularization av vaskulär transplantat är en nyckelfaktor att bestämma vävnadsregenerering och remolding7. Electrospinning, har som en mångsidig teknik, allmänt använts för beredning av vaskulär grafter med nano-fibrös struktur8. Tyvärr, relativt liten por struktur leder ofta till otillräcklig cell infiltration i electrospun vaskulär transplantat, vilket begränsar den efterföljande vävnadsregeneration. Lös problemet genom har olika tekniker varit försökt att öka porstorlek och övergripande porositet, inklusive salt/polymeren urlakning9,10, modifiering av samlare, efter behandling av laserstrålning11 , etc. Strukturera av electrospun transplantat (inklusive fiber diameter, porstorlek och porositet) är i själva verket nära besläktade bearbetning villkor12,13. Under electrospinning, kan fiber diameter lätt styras genom att ändra parametrarna, till exempel koncentrationen av en polymer lösning flöde, spänning, etc. 14 , 15, och därför de porstorlek och porositet har förbättrats med detta.
Vi rapporterade nyligen en modifierad PCL electrospun transplantat med avdunsta struktur (fibrer med diameter 5-7 µm och porerna i 30-40 µm). In vivo implantation genom att ersätta råtta bukaorta visade hög frekvens av patency, samt bra endothelialization och smidig muskel förnyelse vid 3 månader efter operationen16. Viktigare, kunde inga negativa vävnad remodeling bland annat förkalkning och cell regression observeras även efter ett år av implantationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell infiltration är kritisk för upprustning och ombyggnad av vaskulär transplantat i vivo16. Begränsade cell infiltration är ofta relaterade till relativt små porerna i transplantatet som hindrar migration av celler i transplantatet väggen. För att lösa denna svårighet, utvecklat vi en modifierad metod för att förbereda electrospun PCL vaskulär grafter med stor-pore struktur. I detalj, porstorlek ökade med ökningen av fiber tjocklek som lätt kunde styras av processparamet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes ekonomiskt av NSFC projekt (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 och 81401534).
Materials
| Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
| Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
| Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
| Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
| Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
| Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
| Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
| Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
| Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
| Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
| Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
| Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
| Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
| Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
| 5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
| Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
| Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
Referências
- Coombs, K. E., Leonard, A. T., Rush, M. N., Santistevan, D. A., Hedberg-Dirk, E. L. Isolated effect of material stiffness on valvular interstitial cell differentiation. J Biomed Mater Res A. 105 (1), 51-61 (2017).
- Zhang, L., et al. A sandwich tubular scaffold derived from chitosan for blood vessel tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 77 (2), 277-284 (2006).
- Thottappillil, N., Nair, P. D. Scaffolds in vascular regeneration: current status. Vasc Health Risk Manag. 11, 79-91 (2015).
- Pektok, E., et al. Degradation and healing characteristics of small-diameter poly (e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation. Circulation. 118 (24), 2563-2570 (2008).
- Innocente, F., et al. Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular prostheses: a step towards reduction of neointima formation?. Circulation. 120 (11 Suppl), S37-S45 (2009).
- de Valence, S., et al. Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration. Acta Biomater. 8 (11), 3914-3920 (2012).
- Assmann, A., et al. Acceleration of autologous in vivo recellularization of decellularized aortic conduits by fibronectin surface coating. Biomaterials. 34 (25), 6015-6026 (2013).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).
- Baker, B. M., et al. The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers. Biomaterials. 29 (15), 2348-2358 (2008).
- Wang, K., et al. Creation of macropores in electrospun silk fibroin scaffolds using sacrificial PEO-microparticles to enhance cellular infiltration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (12), 3474-3481 (2013).
- Lee, B. L. P., et al. Femtosecond laser ablation enhances cell infiltration into three-dimensional electrospun scaffolds. Acta Biomaterialia. 8 (7), 2648-2658 (2012).
- Rnjak-Kovacina, J., Weiss, A. S. Increasing the pore size of electrospun scaffolds. Tissue Eng Part B Rev. 17 (5), 365-372 (2011).
- Zhong, S., Zhang, Y., Lim, C. T. Fabrication of large pores in electrospun nanofibrous scaffolds for cellular infiltration: a review. Tissue Eng Part B Rev. 18 (2), 77-87 (2012).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospun poly(epsilon-caprolactone) microfiber and multilayer nanofiber/microfiber scaffolds: characterization of scaffolds and measurement of cellular infiltration. Biomacromolecules. 7 (10), 2796-2805 (2006).
- Rnjak-Kovacina, J., et al. Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering. Biomaterials. 32 (28), 6729-6736 (2011).
- Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(epsilon-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nat Mater. 15 (3), 335-343 (2016).
- Tara, S., et al. Well-organized neointima of large-pore poly(L-lactic acid) vascular graft coated with poly(L-lactic-co-epsilon-caprolactone) prevents calcific deposition compared to small-pore electrospun poly(L-lactic acid) graft in a mouse aortic implantation model. Atherosclerosis. 237 (2), 684-691 (2014).
