ターミナル媒介 dUTP を使用してニック終わりラベル (TUNEL) とカスパーゼ 3/7 がカエルツボカビ、カエルのメジャー表皮細胞死に試金します。
Summary
ツボカビの 2 つの方法を使用して、カエルの表皮細胞死を定量化します。まず、臨床的に感染し、感染動物の差異端末媒介 dUTP ニック終わりラベル (TUNEL)その場で組織を使用します。第二に、カスパーゼ 3/7 タンパク質解析を用いた感染症でアポトーシスの時系列分析を行っています。
Abstract
両生類は、世界的に生物多様性に大きな損失を経験している主要な原因の一つ、伝染性の病気カエルツボカビです。病原菌ツボカビ菌(Bd) に感染するとカエルの表皮の妨害によって引き起こされるしかし、病理学的変化があるされて明示的に特徴付けられない。アポトーシス (プログラムされた細胞死) は、ホスト組織を損傷する病原体により使用できますが、耐病性の病原体の除去のためのホスト メカニズムことができます。本研究で我々 は 2 つの異なるアッセイを使用して感染し、感染動物の表皮細胞死を定量化: ターミナル トランスフェラーゼを介した dUTP ニック終わりラベル (TUNEL) とカスパーゼ 3/7。遵守、tunel の腹側、背側と太ももの皮膚組織を使用して細胞表皮細胞はその場で臨床的に感染している動物の死と蛍光顕微鏡を用いた感染動物と細胞死を比較します。感染症はもちろん、表皮におけるアポトーシス レベルはどのように変化を決定するためには、8 週間以上隔週趾先サンプルを削除し、抽出されたタンパク質とカスパーゼ 3/7 試金を使用して、サンプル内の活動を定量化します。我々、伝染ロード カスパーゼ 3/7 アクティビティに関連付けます。TUNEL 法は細胞死の場でのローカリゼーションのため便利ですが、サンプルあたりコストと時間がかかるのです。カスパーゼ 3/7 試金は大きいサンプルの大きさと時間の効率的なコースの実験。ただし、カエルつま先先端生検が小さいので限られた抽出利用できるあるサンプル標準化等を通じたタンパク質定量、ブラッドフォードの試金のため。したがって、サンプルの標準化の中にエキスを消費を避けるためにつま先生検の写真分析を通して皮膚表面積の推定をお勧めします。
Introduction
両生類が現在 1 つすべての脊椎動物の分類群の1のグローバル生物多様性の最大の損失を経験してください。これらの減少の主要な原因は、ツボカビ菌 Bd2病原菌によって引き起こされる致命的な皮膚疾患ツボカビです。病原体表面的に重篤な電解質の喪失、心停止と死3皮膚機能の中断につながることが表皮に感染します。抗菌ペプチド4、5、皮膚細菌叢6免疫細胞受容体7、8など、 Bdに対してさまざまな潜在的なホスト免疫メカニズムを検討中リンパ球の活動9,10。しかし、ほとんどの研究は、上皮のアポトーシスと細胞死がこの致命的な病原体に対して免疫機構かどうかを します。
細胞死のいずれかを介してアポトーシス (プログラムされた細胞死) や表皮の壊死 (プログラムされていない死)、 Bd感染病理があります。前の研究Bd感染可能性があります皮膚外植体を遊走子清体外11.にさらされているとき細胞接合の破壊を観察がアポトーシスを誘導することを示唆しています。さらに、 Bdの退行性表皮変化-電子顕微鏡12,13を使用して感染したカエルを観察。トランスクリプトーム解析を示しアポトーシス経路は、感染した皮膚14で亢進、両生類の脾細胞アポトーシスを受けるは、 Bd の in vitro培養上清15にさらされる場合。Bdが引き起こすことができることを示唆する証拠の増加量にもかかわらずアポトーシスとホストの細胞死体外、体内の研究を探索したり、感染の進行中のメカニズムに欠けているアポトーシスを定量化します。さらに、それは、ホストがBd感染と戦うため防御免疫戦略としてアポトーシスを使用している場合、またはアポトーシスと疾患の病理は、知られているは。
本研究では感染している動物の生体内で2 つの方法を使用して表皮細胞死・ アポトーシスを検出目指して: カスパーゼ 3/7 蛋白質の試金と端末媒介 dUTP ニック終わりラベル (TUNEL)その場での試金。各測定は、細胞死の16のさまざまな側面を検出した、一緒にこれらのメソッドは細胞死に関与するメカニズムの完全な理解を提供し、効果の正確な測定を確保します。カスパーゼ 3/7 アッセイは、両方の組み込みと外因性アポトーシス経路の定量化を可能にするエフェクター カスパーゼ 3 および 7 の活動を定量化します。対照的に、TUNEL アッセイは、アポトーシスや壊死 pyroptosis17を含む細胞死のメカニズムによって引き起こされる DNA 断片化を検出します。TUNEL 法を使用して、3 つの異なる肌のセクションを使用して臨床的に感染していると感染していないの両方の動物の表皮内の細胞死の場所を調査する: 背部、ベンターとPseudophryne のお祭りの腿。このメソッドは、特定の表皮層内での位置を区別することと同様、細胞死の解剖学的サイトを識別します。Litoria verreauxii アルピナで 8 週感染症全体のアポトーシスの時間シリーズの定量化を実施するのにカスパーゼ 3/7 試金を使用しています。我々 は同じ動物から隔週つま先先端サンプルを取る、カスパーゼ 3/7 活動に病原体伝染ロードを関連付けることです。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 は、上皮のアポトーシスおよび致命的な病気カエルツボカビの検査またはBdの影響を受けやすい種の病害抵抗性のメカニズムの潜在的なメカニズムとして細胞死を探った。表皮、tunel 表皮細胞死解析その場での感染の進行中の表皮細胞死を監視するためのカスパーゼ 3/7 アッセイにおける細胞死を評価する 2 つの方法を使いました。細胞死・ アポトーシス伝染ロードに関連?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
飼育とデータ収集を支援した以下の人々 に感謝我々: D. Tegtmeier、C. De Jong、j. ホークス、k. Fossen、s. パーシバル、m. マクウィリアムス、l ・ ベルトーラ、m. スチュワート、N. ハーニー、t. Knavel;M. Merces 解剖について。我々 はまた m ・ マクファデン、P. ハーローとl ・ v ・ アルピナを上げるためタロンガ動物園、G. P. コロボリーを高めるため Marantelli に感謝したいと思います。F. Pasmans、a. マーテル、C. コンスタンティン、A. Kladnik、TUNEL 法について・ r ・ ウェッブのアポトーシスの分析についてのアドバイスを感謝し、t. Emeto との w. Weßels、プロトコル、カスパーゼ 3/7 試金のためのキット。この原稿とプロトコルは Brannellyら2017年ピア J22.から適応します。
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
Referências
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