Utilizando mediada por la transferasa Terminal dUTP Nick End-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis
Summary
Cuantificar la muerte celular epidérmica en ranas con quitridiomicosis usando dos métodos. En primer lugar, utilizamos terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ histología para determinar las diferencias entre animales clínicamente infectados y no infectados. En segundo lugar, llevamos a cabo un análisis de series temporales de la apoptosis sobre la infección usando un análisis de la proteína caspasa 3/7.
Abstract
Anfibios están experimentando una gran pérdida de biodiversidad a nivel mundial y una de las principales causas es la quitridiomicosis enfermedad infecciosa. Esta enfermedad es causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que infecta y afecta epidermis de rana; sin embargo, los cambios patológicos se han no explícitamente caracterizados. Apoptosis (muerte celular programada) puede utilizarse por los patógenos para dañar tejido anfitrión, pero también puede ser un mecanismo de host de resistencia a las enfermedades para la eliminación del patógeno. En este estudio, cuantificar la muerte de las células epidérmicas de los animales infectados y no infectados usando dos análisis diferentes: terminal transferasa-mediated dUTP nick end-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7. Utilizando tejido de piel de muslo y ventral, dorsal, en el ensayo TUNEL, observamos muerte en las células epidérmicas en situ de los animales clínicamente infectados de la célula y comparar la muerte de la célula con los animales no infectados mediante microscopía fluorescente. Para determinar cómo cambian los niveles de apoptosis en la epidermis en el transcurso de la infección extraer muestras de la punta del dedo del pie quincenal durante un período de 8 semanas y utilizar un ensayo de caspasas 3/7 con proteínas extraídas para cuantificar la actividad dentro de las muestras. Entonces correlacionamos actividad de caspasas 3/7 con la carga de la infección. El ensayo TUNEL es útil para la localización de la muerte de la célula en situ, pero es costoso y el tiempo por muestra. El ensayo de caspasas 3/7 es eficaz para tamaños de muestra grandes y tiempo curso de experimentos. Sin embargo, porque las de biopsias punta del dedo del pie de rana son pequeñas hay extracto limitado disponible para estandarización de la muestra a través de métodos de cuantificación de la proteína, tales como el ensayo de Bradford. Por lo tanto, sugerimos estimar el área superficial de la piel a través del análisis fotográfico de las biopsias del dedo del pie para evitar el consumo de los extractos durante la normalización de la muestra.
Introduction
Anfibios están experimentando actualmente una las mayores pérdidas de la biodiversidad global de cualquier taxa vertebrados1. Una de las principales causas de estos descensos son la piel fatal enfermedad chytridiomycosis, causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. El patógeno infecta superficialmente la epidermis, que puede conducir a la alteración de la función de la piel resultando en pérdida del electrólito grave, paro cardiaco y muerte3. Varios mecanismos inmunes del huésped potencial contra Bd actualmente se están estudiando, tales como péptidos antimicrobianos4,5, de la flora bacteriana cutánea6, inmune de la célula receptores7,8, y actividad de linfocitos9,10. Sin embargo, pocos estudios explorarán si epidérmica apoptosis y muerte celular es un mecanismo inmune contra este patógeno mortal.
Muerte celular, ya sea a través de la apoptosis (muerte celular programada) o necrosis (muerte), en la epidermis puede ser una patología de la infección de la Bd . La investigación anterior sugiere que Bd infección puede inducir apoptosis debido a la interrupción de uniones intracelulares se observa cuando los explantes de piel están expuestos a zoospora sobrenadantes en vitro11. Además, cambios degenerativos epidérmicos en Bd-ranas infectadas se observan con microscopia electrónica12,13. Análisis transcriptómico indican que las vías de apoptosis son upregulated en piel infectada14y esplenocitos de anfibios sufren apoptosis cuando son expuestos a Bd sobrenadantes en vitro15. A pesar del creciente volumen de evidencia que sugiere que el Bd puede inducir apoptosis y anfitrión célula muerte en vitro, estudios en vivo que explorar o cuantificar apoptosis carecen de mecanismos a través de la progresión de la infección. Además, se desconoce si el host utiliza apoptosis como una estrategia defensiva inmune para luchar contra la infección de la Bd , o si la apoptosis es una patología de la enfermedad.
En este estudio, el objetivo fue detectar muerte celular epidérmica y apoptosis en animales infectados en vivo usando dos métodos: Análisis de la proteína caspasa 3/7 y terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ ensayo. Como cada ensayo detecta diferentes aspectos de la muerte de la célula16, juntos estos métodos proporcionan un completo entendimiento de los mecanismos implicados en la muerte celular y aseguran una medida exacta del efecto. El ensayo de caspasas 3/7 cuantifica la actividad de las caspasas efectoras 3 y 7, que permite la cuantificación de ambos las vías intrínseca y extrínseca de la apoptosis. En contraste, el ensayo TUNEL detecta la fragmentación del ADN, que es causada por mecanismos de muerte celular incluyendo apoptosis, necrosis y pyroptosis17. Utilizamos el ensayo TUNEL para investigar la situación de muerte celular en la epidermis de los animales clínicamente infectados y no infectados con tres secciones de piel diferentes: el dorso, el vientre y el muslo de Pseudophryne corroboree. Este método identifica el sitio anatómico de la muerte de la célula, como distinguiendo su ubicación dentro de capas epidérmicas específicas. Entonces utilizamos el análisis de caspasas 3/7 para llevar a cabo una cuantificación de la serie de tiempo de la apoptosis a través de una infección de 8 semanas en Litoria verreauxii alpina. Tomar muestras de punta de dedo del pie quincenal de los mismos animales y son capaces de correlacionar la carga de infección del patógeno con la actividad de caspasas 3/7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Exploramos epidérmico apoptosis y muerte celular como un mecanismo potencial de la patología de la quitridiomicosis enfermedad mortal o un mecanismo de resistencia a enfermedades en especies susceptibles de Bd . Se utilizaron dos métodos de evaluar la muerte celular en la epidermis, ensayo TUNEL en situ análisis de muerte celular epidérmica y caspasas 3/7 análisis para monitoreo de muerte de las células epidérmicas a lo largo de la evolución de la infección. Se encontró que la muerte celular …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a las siguientes personas que ayudaron con cría y recogida de datos: Tegtmeier D. C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, Percival S., M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, Harney N. y T. Knavel; y M. Merces ayuda con disecciones. También nos gustaría agradecer a M. McFadden, P. Harlow y Taronga Zoo para aumentar la L. v. alpinay G. Marantelli para levantar los p. corroboree. Agradecemos a F. Pasmans, A. Martel para asesoramiento en ensayos de apoptosis, Constantino C., Kladnik A. y R. Webb ayuda con ensayo TUNEL, y Emeto T. y W. Weßels para ayudan con el protocolo y kit para análisis de caspasas 3/7. Este manuscrito y el protocolo se ha adaptado de Brannelly et al 2017 Peer J22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
Referências
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
- Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
- Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
- Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
- Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
- Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
- Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
- Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
- Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
- Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
- Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
- Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
- Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
- Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
- Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
- Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
- Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).
