المؤتلف الكولاجين أنا ميكروكاريرس الببتيد لتوسيع الخلية وإمكانية استخدامها كنظام إيصال خلية في مفاعل حيوي نموذج
Summary
ونقترح وضع بروتوكول توسيع خلية على ميكروكاريرس ماكروبوروس واستخدامها كنظام التسليم بمفاعل حيوي نضح البذور مصفوفة أنسجة ديسيلولاريزيد. نحن تشمل أيضا تقنيات مختلفة لتحديد انتشار الخلايا وقدرتها على البقاء للخلايا المزروعة في ميكروكاريرس. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر وظيفة الخلايا بعد الثقافات مفاعل حيوي.
Abstract
هندسة الأنسجة حقل واعدة، ركزت على وضع حلول لزيادة الطلب على الأنسجة والأعضاء فيما يتعلق بأغراض الزرع. عملية لتوليد مثل هذه الأنسجة معقد، ويشمل مجموعة مناسبة من أنواع الخلايا المحددة والسقالات والمنبهات الفيزيائية أو الكيميائية الحيوية لتوجيه نمو الخلايا وتمايزها. ميكروكاريرس تمثل أداة جذابة لتوسيع نطاق الخلايا في المكروية (3D) ثلاثي الأبعاد، نظراً لأنها توفر أعلى سطح لنسب حجم وتقليد أكثر عن كثب الوضع في فيفو مقارنة بالأساليب التقليدية ثنائية الأبعاد. الأوعية الدموية، توفير الأوكسجين والمغذيات إلى الخلايا، وضمان التخلص من النفايات، يشكل لبنة هامة عند توليد هندسة الأنسجة. في الواقع، تفشل معظم ثوابت بعد يتم زرعها بسبب تفتقر إلى دعم الأوعية الدموية. في هذه الدراسة، نقدم على بروتوكول لتوسيع نطاق الخلية البطانية على المؤتلف ميكروكاريرس المستندة إلى الكولاجين تحت ظروف ديناميكية في قارورة غزل والمفاعلات الحيوية، ونشرح كيفية تحديد في هذا الإعداد خلية السلامة والأداء الوظيفي. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقترح أسلوب لإيصال خلية لأغراض الأوعية الدموية دون كتيبة إضافية الخطوات اللازمة. وعلاوة على ذلك، نحن نقدم استراتيجية لتقييم الأوعية الدموية خلية المحتملة في مفاعل حيوي التروية في مصفوفة بيولوجية ديسيلولاريزيد. ونحن نعتقد أن استخدام أساليب عرض يمكن أن يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة تستند إلى خلية لمجموعة كبيرة من الأنسجة هندسة تطبيقات في الممارسة السريرية.
Introduction
مشكلة عامة في تطبيقات هندسة الأنسجة تسفر عن كتلة خلايا عالية مع النمط الظاهري التفريق الصحيح في الموقع لحاجة. وبدأ تطبيق ميكروكاريرس لمعالجة هذه المسألة في عام 1967 مع تزايد أهمية حتى الآن في مجالات مثل هندسة الأنسجة العظام لجيل على نطاق واسع للجلد والعظام والغضاريف والاوتار1. يسمحون بالتعامل مع ثقافات ملتصقة بطرق مماثلة لتلك الثقافات تعليق2 بتوسيع نطاق الخلايا في عبارة ثلاثية الأبعاد (3D) ركائز. وبالتالي تجربة الخلايا على إمدادات المواد الغذائية متجانسة وتفاعلات الخلية-مصفوفة أن تؤدي إلى تحسين صيانة في فيفو3،4 التمايز الذي كثيرا ما تفقد على مر الزمن في 2D النهج5. نسبة السطح إلى الحجم أعلى-مما يؤدي في النهاية الخلية أعلى غلة6،7، ارتفاع الغاز والمغذيات أسعار الصرف مقارنة بنظم ثابتة8، إمكانية تنظيم ورهنا بالثقافة البدنية المحفزات9، والقدرة على الارتقاء بعملية التوسع في7 هي زيادة المزايا. العديد من الميزات مثل القطر، وكثافة، المسامية، تهمة السطحية، والتصاق خصائص10،11 التمييز المختلفة المتاحة تجارياً الصغرى-والكلى-الناقلين. ومع ذلك، واحدة من الميزة الرئيسية هو إيصالها المحتملة ميكروتيسويس للموقع عيب أو الطلب.
لتطبيقات التكنولوجيا ميكروكارير في هندسة الأنسجة العظام، ونحن يتضح في تقرير سابق12 الإنتاج ميكروكارير جديدة نوع تشكل الكولاجين المؤتلف أنا الببتيد (الحزب الشيوعي الثوري، المتاحة تجارياً سيلنيست). يسمح هذا ميكروكارير الجديدة GMP متوافقة مع زيادة حجم الإنتاج سقالة والخلية، حسب الحاجة لإيصال خلية في سيناريو سريرية. وفي هذا السياق، ضبط الاستقرار سقالة ومعدل التدهور، والخصائص السطحية من خلال الاختيار السليم لوضع استراتيجية مناسبة crosslinking يسمح بتكييف هذه التقنية للتطبيق المحدد أو خلية نوع من الفائدة أو استهداف الأنسجة13. على وجه الخصوص، العمالة المحتملة لهذا ميكروكارير كنظام توصيل خلية القابلة لحقن للتطبيق العلاجي14 يجعلها مثيرة للاهتمام لا سيما في إعداد سريرية.
في هذه الورقة، ونحن لذلك توضيح تثقيف إجراءات العزل وتوسيع البشرية المشتقة من نخاع العظم stromal الخلايا الوسيطة (هبمسكس) والجلد microvascular غشائي الخلايا البشرية (هدميكس) في المؤتلف الكولاجين-أنا-تعتمد على أساس الببتيد ميكروكاريرس، وإعدادها للتسليم في إعداد سريرية. وعلاوة على ذلك، يمكننا وصف بروتوكولات إضافية مفيدة للحفاظ على بقاء الخلية على غرس.
بقاء الخلية بعد زرع في الواقع يعتمد بشدة على الأوعية الدموية15،،من1617، مما يضمن تبادل الأوكسجين والمغذيات ويسهل التخلص من النفايات. المفاعلات الحيوية تشكل نهج واحد للتغلب على التحديات الأوعية الدموية في هندسة الأنسجة، والمحافظة على بقاء الخلية، من خلال نضح للثقافة المتوسطة وبالتالي توفير الأوكسجين والمغذيات18. نحن هنا، لتوضيح أسلوب في المختبر لتقييم القدرة على الهجرة من الخلايا البطانية ميكروفاسكولار من ميكروكاريرس RCP بيوماتريكس وقدرتها على الإسهام في حيثياته الأوعية الدموية والأوعية. هذا بيوماتريكس هو جزء ديسيلولاريزيد من صائم الخنزير يسمى بيوفاسك (سقالة Vascularized البيولوجية)، غنية بالكولاجين والايلاستين ومع الحفاظ على هياكل الأوعية الدموية، الذي يشتمل تغذية شريان و الوريد استنزاف19 قد تم تطبيق لغرس قضايا20.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحد والهدف الرئيسي من ميكروكارير هو توسيع نطاق الخلايا مع الحفاظ على التمايز بهم بغية إيصال الخلايا إلى مكان الحاجة. إدخال أسلوب تمثيل RCP ميكروكاريرس حيث كانت الخلايا قادرة على إرفاق وتتكاثر واستعمار في ميكروكاريرس مع خلية عالية الكثافة. وقد لوحظ بالعيش/الميت تلطيخ، التي تم الكشف عن أكث?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
البحوث المؤدية إلى هذه النتائج قد تلقت تمويلاً من الاتحاد الأوروبي السابعة إطار برنامج FP7/2007-2013 ضمن اتفاق منحة جوان 607051 (بيو-الهام). ونحن نشكر كارولين فإن سبريويل جوسينس من فوجي فيلم تصنيع أوروبا B.V.، للمساعدة التقنية أثناء التصنيع RCP، و “ستراك فيرنر” من معهد فراونهوفر “سيليكات بحوث مركز الدراسات الدولي”، للمساعدة في التحليل ووزارة شؤون المرأة.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
Referências
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O’Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O’Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
