Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model
Summary
Wij stellen voor een cel expansie protocol betreffende macroporeuze microcarriers en hun gebruik als levering systeem in een bioreactor perfusie om het zonebeheer van een matrix decellularized weefsel. Wij omvatten ook verschillende technieken om te bepalen van celproliferatie en levensvatbaarheid van cellen gekweekt op microcarriers. Bovendien tonen we functionaliteit van cellen na bioreactor culturen.
Abstract
Weefseltechnologie is een veelbelovend gebied, gericht op het ontwikkelen van oplossingen voor de toenemende vraag op de weefsels en organen voor transplantatiedoeleinden. Het proces voor het genereren van dergelijke weefsels is complex en omvat een passende combinatie van specifieke celtypes, steigers en fysieke of biochemische prikkels om te leiden van de celgroei en differentiatie. Microcarriers vormen een aantrekkelijk instrument uit te breiden van cellen in een driedimensionale (3D) communicatie, omdat ze hogere oppervlak-volume ratio’s geven en de in vivo situatie vergeleken met traditionele tweedimensionale methoden nauwer wordt nagebootst. Het vaatstelsel, de levering van zuurstof en voedingsstoffen naar de cellen en het waarborgen van de verwijdering van het afval, vormt een belangrijke bouwsteen wanneer weefsels genereren ontworpen. In feite, mislukken de meeste constructies na wordt geïmplanteerd te wijten aan het ontbreken van vasculaire ondersteuning. In deze studie, presenteren we een protocol voor endothelial cel expansie op recombinante collageen gebaseerde microcarriers onder dynamische omstandigheden in spinner kolf en bioreactoren en leggen we uit hoe u kunt bepalen in dit de levensvatbaarheid van de cellen van de instelling en functionaliteit. Daarnaast stellen wij een methode voor de levering van de cel voor vascularisatie doeleinden zonder extra detachement stappen die nodig zijn. Bovendien bieden wij een strategie om te evalueren van de cel vascularisatie potentiële in een bioreactor perfusie op een decellularized biologische matrix. Wij zijn van mening dat het gebruik van de gepresenteerde methoden kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe cel-gebaseerde therapieën voor een groot scala aan weefsel technische toepassingen in de klinische praktijk.
Introduction
Een algemeen probleem in weefsel waterbouwkundige toepassingen is moeten opleveren van de massa van een hoge cel met het fenotype van de juiste differentiatie op de locatie van. De toepassing van microcarriers aan te pakken dit probleem begon in 1967 met toenemende betekenis toe op gebieden zoals orthopedische weefselengineering voor grootschalige generatie van huid, botten, kraakbeen en pezen1. Zij toestaan dat de behandeling van aanhangend culturen op manieren gelijkend op dat van schorsing culturen2 door cellen op microscale driedimensionale (3D) substraten uit te vouwen. Daardoor ervaren cellen een homogene voedingsstoffen levering en cel-matrix interacties dat leiden tot beter onderhoud van in vivo3,4 differentiatie, die vaak verloren na verloop van tijd in 2D5 benaderingen. Een hogere oppervlak-te-volumeverhouding – uiteindelijk zal leiden tot hogere cel opbrengsten6,7, hogere gas en nutriënten wisselkoersen vergelijken met statische systemen8, de mogelijkheid om te reguleren en de cultuur onderworpen aan fysieke prikkels9, en de mogelijkheden voor schaalvergroting van de uitbreiding proces7 zijn verdere voordelen. Verschillende functies zoals diameter, dichtheid, porositeit, oppervlakte lading en hechting eigenschappen10,11 onderscheid maken tussen de verschillende commercieel beschikbare micro – en macro-dragers. Één van het belangrijkste voordeel is echter hun potentieel als microtissues levering aan site defect of vraag.
Voor toepassingen van de technologie van de microcarrier in bot weefselengineering, we geïllustreerd in een vorige verslag12 de productie van een nieuwe microcarrier type bestaat uit een recombinant collageen ik peptide (RCP, commercieel beschikbaar als Cellnest). Deze nieuwe microcarrier kunt de GMP-conforme een schaal voor de productie van de steiger en cel, als nodig is voor de levering van de cel in een klinische scenario. In dit verband kunt afstemming van de stabiliteit van de steiger, aantasting van het tarief en oppervlakte-eigenschappen door middel van de juiste keuze van een geschikt crosslinking strategie passen de techniek om de geselecteerde toepassing, cell type van belang of target weefsel13. In het bijzonder maakt de potentiële tewerkstelling van deze microcarrier als een injecteerbare cel expresbezorgingssysteem voor therapeutische toepassing14 ze bijzonder interessant in een klinische setting.
In deze paper illustreren we daarom de kweken procedure voor de isolatie en de uitbreiding van de menselijke beenmerg-afgeleide mesenchymale stromale cellen (hBMSCs) en menselijke dermale microvasculaire endotheliale cellen (HDMECs) op collageen ik-gebaseerde recombinant Peptide gebaseerde microcarriers, en hun bereiding voor levering in een klinische setting. Daarnaast beschrijven we aanvullende protocollen nuttig voor het onderhoud van de levensvatbaarheid van de cellen op innesteling.
Levensvatbaarheid van de cellen na implantatie is in feite sterk afhankelijk van vascularisatie15,16,17, die zorgt voor een uitwisseling van zuurstof en voedingsstoffen en afvalstoffen verwijdering vergemakkelijkt. Bioreactoren vormen één aanpak vascularisatie uitdagingen in de weefselkweek en handhaven van de levensvatbaarheid van de cellen, via perfusie van kweekmedium verstrekken waardoor zuurstof en voedingsstoffen18. We illustreren hier, een in vitro -methode om te evalueren van het vermogen van de migratie van microvasculaire endotheliale cellen van de RCP microcarriers een biomatrix en hun vermogen om bij te dragen aan de DOVO vascularisatie en angiogenese. Deze biomatrix is een decellularized segment van varkens jejunum genoemd BioVaSc (biologische gevacuoliseerd steiger), rijk aan collageen en elastine en bewaard met vasculaire structuren, waaronder een voeding slagader en een zuig ader19 dat is geweest implantatie kwesties20aangevraagd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een hoofddoel van microcarrier is de uitbreiding van cellen met behoud van hun differentiatie zodat u cellen naar de plaats van noodzaak. De vertegenwoordigde methode introduceren RCP microcarriers waar cellen konden toevoegen, vermenigvuldigen en koloniseren de microcarriers met hoge celdichtheid. Dit werd waargenomen door live/dead kleuring, waarin meer dan 90% van levensvatbare cellen werden ontdekt, terwijl slechts een paar dode cellen werden verkregen na 7 dagen van dynamische culturen. Ook bevestigd de beelden van …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek leidt tot deze resultaten is financiering van de Europese Unie zevende kader programma KP7/2007-2013 onder grant overeenkomst n ° 607051 (BIO-INSPIRE) ontvangen. Wij danken Carolien van Spreuwel-Goossens van Fujifilm Manufacturing Europe B.V., voor de technische bijstand tijdens RCP productie en Werner Stracke van Fraunhofer Instituut voor silicaat onderzoek ISC, voor hulp bij de SEM-analyse.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
Referências
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O’Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O’Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
