Живые клетки изображений сегрегации хромосом в процессе митоза
Summary
Этот протокол описывает метод простой и удобный ярлык и визуализировать Живые хромосомы митотическая клеток Histone2B-GFP BacMam 2.0 label и система конфокальной микроскопии диск спиннинг.
Abstract
Хромосомы должны быть надежно и равномерно делятся на клетки дочи процессе митотического деления клетки. Верность хромосомных сегрегации управляется несколько механизмов, которые включают шпиндель контрольно-пропускного пункта Ассамблея (SAC). SAC является частью сложной обратной связи системы, которая отвечает за предотвращение клетки прогресса путем митоза если все хромосомных kinetochores придают шпинделя микротрубочек. Хромосомная отстающих и аномальные хромосомы сегрегация является показателем неблагополучных клеточного цикла управления контрольно-пропускных пунктов и может использоваться для измерения геномная стабильность делящихся клеток. Дерегулирование мешка может привести к трансформации нормальной клетки в злокачественных клеток путем накопления ошибок при хромосомных сегрегации. Осуществление SAC и формирование комплекса Кинетохор жестко регулируются взаимодействия между киназы и фосфатазы например фосфатазы Протеин 2A (PP2A). Этот протокол описывает изображений живой клетки отстает хромосом в мыши эмбриональных фибробластов, изолированные от мышей, которые были нокаут Субблок регулирования PP2A-B56γ. Этот метод преодолевает недостатки других клеточного цикла управления методы визуализации как проточной цитометрии или immunocytochemistry только обеспечивают моментальный снимок статуса цитокинез клетки, вместо динамического пространственно-временных визуализации хромосом в процессе митоза.
Introduction
В следующий протокол мы описываем удобный метод для визуализации хромосомных сегрегации и митотического прогрессии во время клеточного цикла в эмбриональных фибробластов мыши с помощью гистона 2B-GFP, BacMam 2.0 маркировки и живых клеток.
Клеточный цикл контрольно-пропускных пунктах контролировать хромосома сегрегации и играют важную роль в поддержании генетических целостность клеток в 1,2,3. Накопление неправильного сегрегированных хромосом может привести к анеуплоидии, который является отличительной чертой наиболее твердые туморы 4. Следовательно выявления отстающих хромосом может использоваться как метод для изучения хромосомной нестабильности.
Дневно помечены белки могут быть использованы для визуализации Живые хромосомы сегрегации и хромосомных отставание но поколение mCherry тегами или H2B-GFP с тегами белка требует существенных знаний для доставки и молекулярной биологии гена 5. Здесь мы описываем использование реагента CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, называемой CL-HB регент, ради простоты. Этот реактив может быть использован сразу и таким образом, устраняет беспокойство вектор качества и целостности. Кроме того этот реагент не требует использования потенциально вредных лечения или липидов и химических красителей загрузки. В отличие от обычных флуоресцентные метки, регент CL-HB пятна независимо от функции (т.е., мембранного потенциала). CL-HB регент могут быть просто добавлены к клеткам и инкубированы всю ночь для выражения протеина. CL-HB регент не реплицировать в клетках млекопитающих и может использоваться в параметры 1 лаборатории биобезопасности уровня (BSL). Кроме того этот временной transfection может быть обнаружен после ночи инкубации до 5 дней, достаточно времени для выполнения самых динамичных клеточного анализа.
В качестве альтернативы хромосомные аномалии может быть изучен различные методы, такие как проточной цитометрии, иммуногистохимия или флуоресценции в situ гибридизация (рыба) 6. Проточной цитометрии могут быть использованы для изучения анеуплоидии, которая может быть измерена на основе содержания ДНК и этапа клеток в клеточный цикл. Хотя проточной цитометрии может быть использован для измерения анеуплоидии, он не представить информацию о хромосомных неправильного сегрегации. Рыба и иммуногистохимии методы использования флуоресцентных зондов связываться с ДНК или хромосомы. Хотя эти методы обеспечивают моментальный снимок состояния популяции клеток, они не позволяют живой клетки, изображений, тем самым отсутствие любой информации, полученной через пространственно-временных визуализации цитокинез в определенные ячейки в течение определенного периода времени.
Этот протокол был использован для изучения хромосом отстает или хромосомных неправильного сегрегации в Нокодазол лечение мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) изолированы от PP2A-B56γ-мышей. В дополнение к выше приложения этот протокол обеспечивает простой инструмент для этикетки и визуализировать хромосомных сегрегации в различных типах клеток, которые могут быть использованы для изучения регуляции клеточного цикла или хромосомной нестабильности в опухолевых клетках. Кроме того он также может использоваться для изучения хромосомной нестабильности, вызванной различных лекарств или для изучения последствий Нокаут гена результате хромосомной неправильного сегрегации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клеточный цикл управления контрольно-пропускные пункты, которые обеспечивают точные хромосома сегрегации предотвратить анеуплоидии и ячейки преобразования 1,2,3. В настоящем исследовании, мы обнаружили, что инактивирование PP2A-B56γ прив…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить доктора Хунг го-Chiuan и д-р Bharatkumar Джоши за ценные замечания, которые улучшили рукопись.
Materials
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
Referências
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, 966-980 (2012).
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
