Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme
Summary
Bu iletişim kuralı etiket ve canlı kromozomlar Mitotik hücre Histone2B-GFP BacMam 2.0 etiket ve bir iplik kaset confocal mikroskobu sistemi kullanarak görselleştirmek için basit ve uygun bir yöntem açıklanır.
Abstract
Kromozomlar düzgün ve güvenilir bir şekilde kızı hücrelere Mitotik hücre bölünmesi sırasında ayrılmış gerekir. Kromozom segregasyon kalitesini Milli Meclis denetim noktası (SAC) içeren birden fazla mekanizma ile kontrol edilir. Bu zarın içinde durur bütün kromozom kinetochores mikrotübüller iğ bağlı sürece mitoz hücre ilerlemeyi önlenmesi için sorumlu olan bir karmaşık geribildirim sisteminin bir parçasıdır. Kromozom ahşap kaplama ve anormal kromozom segregasyon işlevsel olmayan hücre döngüsü kontrol denetim noktaları bir göstergesidir ve hücre bölünmesi genomik istikrar ölçmek için kullanılabilir. SAC deregülasyon normal bir hücre dönüştürme hataları biriktirme esnasında kromozom segregasyon aracılığıyla bir malign hücre içine neden olabilir. Kinaz ve fosfataz gibi Protein fosfataz 2A arasındaki etkileşimler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmiş SAC uygulanması ve karmaşık kinetochore oluşumunu (PP2A). Bu iletişim kuralı kromozomlar fare embriyonik fibroblastlar vardı bir PP2A-B56γ yasal alt birimi nakavt fareler izole içinde kalmış, canlı hücre görüntüleme açıklar. Bu yöntem yalnızca bir hücre sitokinez durumu, dinamik bir kronolojik zamanmekansal görselleştirme kromozomların yerine bir görüntüsünü sağlayan diğer hücre döngüsü kontrol görüntüleme teknikleri Akış Sitometresi veya immunocytochemistry gibi eksikliklerin üstesinden gelir. mitoz sırasında.
Introduction
Aşağıdaki iletişim kuralında, kromozom segregasyon ve fare embriyonik fibroblastlar Histon 2B-GFP ve canlı hücre görüntüleme BacMam 2.0 etiketleme kullanarak hücre döngüsü sırasında Mitotik ilerleme görselleştirmek için uygun bir yöntem açıklanmaktadır.
Hücre döngüsü kontrol denetim noktaları kromozom segregasyon izlemek ve hücre 1,2,3genetik bütünlük bakımından önemli bir rol oynamaktadır. Yanlış ayrılmış kromozomlar birikimi anöploidi için hangi en sağlam tümörleri 4özelliğidir yol açabilir. Bu nedenle, kromozomlar gerisinde kalmış algılama yöntemi olarak kromozom istikrarsızlık eğitim için kullanılabilir.
Fluorescently etiketli proteinler canlı kromozom segregasyon görselleştirmek için kullanılan ve kromozom mCherry öğesini nesil geri kalmış olabilir veya H2B GFP öğesini protein gen teslim ve moleküler biyoloji 5önemli bilgi gerektirir. Burada CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0 reaktif, bundan sonra basitlik uğruna CL-HB regent denilen nasıl kullanılacağını açıklar. Bu reaktif hemen kullanılabilir ve böylece vektör kalite ve bütünlüğü konusunda endişeleriniz ortadan kaldırır. Buna ek olarak, bu reaktif zararlı olabilecek tedaviler veya lipidler ve boya-yükleme kimyasalların kullanımını gerektirmez. Geleneksel floresan etiketleri farklı olarak, CL-HB regent işlev bağımsız olarak lekeleri (i.e., membran potansiyeli). CL-HB regent sadece hücrelere eklendi ve gecede inkübe protein ifade için. CL-HB regent memeli hücrelerinde çoğaltmak ve biyogüvenlik düzeyi (BSL) 1 laboratuvar ayarlarında kullanılabilir. Ayrıca, bu geçici transfection 5 güne kadar yeterli zaman gece kuluçka sonra en dinamik hücresel analizler taşımak için tespit edilebilir.
Alternatif olarak, kromozom Akış Sitometresi, immünhistokimya veya Floresans in situ hibridizasyon (balık) 6‘ gibi çeşitli teknikleri eğitim. Akış Sitometresi ölçülebilir DNA içeriği ve hücre hücre döngüsünün aşaması dayalı anöploidi, çalışma için kullanılabilir. Akış Sitometresi anöploidi ölçmek için kullanılabilmesine rağmen kromozom mis segregasyon üzerinde bilgi sağlamaz. Balık ve immünhistokimya teknikleri floresan problar DNA veya kromozomlar bağlamak için kullanın. Bu tekniklerin bir anlık görüntüsünü hücre bir popülasyon durumunu sağlarken, Bunlar canlı hücre böylece kronolojik zamanmekansal görselleştirme sitokinez belirli hücrelere bir süre içinde takip sırasında elde edilen herhangi bir bilgi eksik görüntüleme izin vermez.
Bu iletişim kuralı ahşap kaplama kromozomlar veya PP2A-B56γ-fareler izole kromozom mis segregasyon tedavi nocodazole fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) de incelemek için kullanıldı. Uygulama yukarıda ek olarak, bu iletişim kuralı etiket ve hücre döngüsü Yönetmeliği okumak için kullanılan çeşitli hücre tiplerinin kromozom segregasyon veya tümör hücrelerinde kromozom istikrarsızlık görselleştirmek için basit bir araç sağlar. Buna ek olarak, bu da kromozom istikrarsızlık tarafından çeşitli ilaç tedavileri neden çalışmaya veya Kromozom mis segregasyon kaynaklanan dışarı gen knock etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doğru kromozom segregasyon sağlamak hücre döngüsü kontrol denetim noktaları dönüşüm 1,2,3anöploidi ve hücre önlemek. Bu da çalışmanın, PP2A-B56γ o inactivation bulduk zayıflamış Milli Meclis denetim noktası içinde sonuçlandı. Canlı hücre görüntüleme kromozom mis ayrışma sırasında mitoz PP2A-B56γ MEFs içinde nocodazole 9ile tedavi gözlemlemek için bize izin.
<p cl…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Guo-Chiuan Hung ve Dr Bharatkumar Joshi el yazması geliştirilmiş değerli yorum için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
Referências
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, 966-980 (2012).
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
