تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام
Summary
ويصف هذا البروتوكول طريقة سهلة ومريحة التسمية ووضع تصور للكروموزومات الحية في الخلايا الانقسامية باستخدام تسمية 2.0 باكمام Histone2B-التجارة والنقل ونظام الفحص المجهري [كنفوكل] قرص غزل.
Abstract
الكروموسومات يجب موثوق بها وموحدة عزلهم في خلايا ابنه أثناء انقسام الخلية الانقسامية. ويسيطر الإخلاص لفصل الكروموسومات الآليات المتعددة التي تشمل تفتيش الجمعية المغزل (SAC). الكيس هو جزء من نظام التغذية المرتدة المعقدة التي المسؤولة عن منع تقدم الخلية عن طريق الانقسام ما لم تعلق جميع كينيتوتشوريس الصبغية على مغزل microtubules. الصبغية متخلفة وكروموسوم الشاذ العزل مؤشرا من نقاط التفتيش لمراقبة دورة الخلية المفككة، ويمكن استخدامها لقياس استقرار الجينوم تقسيم الخلايا. يمكن أن يؤدي إلغاء الضوابط التنظيمية للكيس في تحول الخلية العادية إلى خلية خبيثة من خلال تراكم الأخطاء أثناء فصل الكروموسومات. تنفيذ الكيس وتشكيل kinetochore معقدة محكم وينظم التفاعلات بين مؤنزم والفوسفاتيز مثل 2A “الفوسفاتيز البروتين” (PP2A). ويصف هذا البروتوكول تصوير الخلية الحية المتخلفة الكروموسومات في الخلايا الليفية الجنينية الماوس المعزولة من الفئران التي كانت بالضربة قاضية فرعية تنظيمية PP2A-B56γ. هذا الأسلوب ويتغلب على أوجه القصور في دورة الخلية تحكم التصوير تقنيات أخرى مثل التدفق الخلوي أو إيمونوسيتوتشيميستري التي لا توفر سوى لقطة مركز سيتوكينيسيس الخلية، بدلاً من تصور الزمانية المكانية دينامية من الكروموسومات وخلال الانقسام.
Introduction
في بروتوكول التالية، ويصف لنا طريقة ملائمة لتصور فصل الكروموسومات والانقسامية التقدم خلال دورة الخلية في الخلايا الليفية الجنينية الماوس استخدام هيستون 2B-التجارة والنقل، ووسم باكمام 2.0 وتصوير الخلايا الحية.
رصد الفصل كروموسوم نقاط التفتيش لمراقبة دورة الخلية وتلعب دوراً هاما في الحفاظ على سلامة الوراثية من الخلية2،،من 13. تراكم الكروموسومات سوء منفصلة يمكن أن تؤدي إلى انيوبلويدي، ومن السمات مميزة ل الأورام الأكثر صلابة 4. ومن ثم، يمكن استخدام الكشف المتخلفة الكروموسومات كأسلوب لدراسة كروموسومية عدم الاستقرار.
فلوريسسينتلي المسمى البروتينات يمكن استخدامها لتصور العزل كروموسوم يعيش وصبغية متخلفة لكن توليد مشري معلم أو البروتين بروتينات فلورية خضراء H2B معلم يتطلب معرفة كبيرة بالجينات التسليم والبيولوجيا الجزيئية 5. هنا يصف لنا استخدام كاشف سلليت Histone2B-التجارة والنقل باكمام 2.0، يشار إلى ريجنت CL-غبطة، توخياً للبساطة. هذا الكاشف يمكن استخدامها فورا وهكذا يزيل المخاوف من ناقلات جودة وسلامة. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب هذا الكاشف استخدام العلاجات يمكن أن تكون ضارة أو الدهون وصبغ-تحميل المواد الكيميائية. خلافا لتسميات الفلورسنت التقليدية، البقع ريجنت CL-غبطة مستقلة عن وظيفة (أي.، غشاء المحتملة). يمكن ببساطة إضافة إلى الخلايا ريجنت CL-غبطة والمحتضنة بين عشية وضحاها للتعبير البروتين. ريجنت CL-غبطة لا النسخ المتماثل في خلايا الثدييات، ويمكن استخدامها في إعدادات المختبر 1 (BSL) مستوى السلامة الأحيائية. أيضا، يمكن الكشف عن هذه تعداء عابرة بعد الحضانة بين عشية وضحاها ليصل إلى 5 أيام، ما يكفي من الوقت القيام بالتحاليل الخلوية الأكثر دينامية.
وبدلاً من ذلك، يمكن دراسة التشوهات الصبغية بتقنيات مختلفة مثل التدفق الخلوي أو إيمونوهيستوتشيميستري أو الأسفار في الموقع التهجين (الأسماك) 6. يمكن استخدام التدفق الخلوي لدراسة انيوبلويدي، التي يمكن أن تقاس على أساس محتوى الحمض النووي والمرحلة من الخلايا في دورة الخلية. على الرغم من أن يمكن استخدام التدفق الخلوي لقياس انيوبلويدي، لا تقديم معلومات عن العزل سوء الكروموسومات. استخدام تقنيات الأسماك و immunohistochemistry المسابير الفلورسنت لربط الحمض النووي أو الكروموسومات. في حين أن هذه التقنيات توفر لمحة سريعة عن حالة سكان خلايا، أنها لا تسمح خلية يعيش التصوير مما يؤدي إلى ضياع أي معلومات تم الحصول عليها من خلال التصور الزمانية المكانية سيتوكينيسيس في خلايا معينة اتبعت على مدى فترة من الزمن.
وكان استخدام هذا البروتوكول لدراسة الكروموسومات متخلفة أو العزل سوء كروموسومية في نوكودازولي معاملة الماوس الليفية الجنينية (ميفس) المعزولة من PP2A-B56γ-الفئران. بالإضافة إلى أعلاه التطبيق، يوفر هذا البروتوكول أداة بسيطة التسمية ووضع تصور للعزل كروموسومية في مختلف أنواع الخلايا التي يمكن استخدامها لدراسة تنظيم دورة الخلية أو عدم استقرار الكروموسومات في الخلايا السرطانية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدامه لدراسة كروموسومية عدم الاستقرار الناجم عن العلاج بالعقاقير المختلفة أو لدراسة آثار ضرب الجينات أدى إلى فصل سوء الصبغية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقاط التفتيش لمراقبة دورة الخلية التي تضمن الفصل كروموسوم دقيق منع انيوبلويدي وخلية التحول 1،،من23. في هذه الدراسة، وجدنا أن المنظمة من PP2A-B56γ أدت إلى نقطة تفتيش الجمعية مغزل ضعف. تصوير الخلايا الحية سمح لنا بمراقبة العزل سوء الصبغية خلال ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور كيوان قوة هونغ والدكتور بهاراتكومار جوشي على التعليقات القيمة التي تحسن المخطوطة.
Materials
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
Referências
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, 966-980 (2012).
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
