Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi
Summary
Questo protocollo descrive un metodo facile e conveniente per etichettare e visualizzare live cromosomi nelle cellule mitotiche utilizzando etichetta Histone2B-GFP BacMam 2.0 e un sistema di microscopia confocal di filatura disco.
Abstract
Cromosomi devono essere uniformemente e in modo affidabile suddivise in cellule della figlia durante la divisione cellulare mitotica. Fedeltà della segregazione cromosomica è controllata da meccanismi multipli che includono il mandrino Assembly Checkpoint (SAC). Il SAC è parte di un sistema di feedback complessi che è responsabile per la prevenzione di un progresso delle cellule attraverso la mitosi, a meno che tutti i cinetocori cromosomici hanno attaccato per mandrino microtubuli. Cromosomiche in ritardo e cromosoma anormale segregazione è un indicatore di checkpoint di controllo del ciclo cellulare disfunzionale e può essere usata per misurare la stabilità genomica di divisione delle cellule. Deregolamentazione del SAC può causare la trasformazione di una cellula normale in una cellula maligna attraverso l’accumulo di errori durante la segregazione cromosomica. Implementazione del SAC e la formazione del cinetocore complesse sono strettamente regolati dalle interazioni tra chinasi e fosfatasi come proteina fosfatasi 2A (PP2A). Questo protocollo descrive live cell imaging di in ritardo di cromosomi in fibroblasti embrionali di topo isolate da topi che avevano un knockout della subunità regolatoria di PP2A-B56γ. Questo metodo sormonta le imperfezioni di altri ciclo cellulare controllo tecniche di imaging quali la citometria a flusso o immunocitochimica che forniscono solo un’istantanea di uno stato di citochinesi cellulare, invece di una visualizzazione dinamica spazio-temporale dei cromosomi durante la mitosi.
Introduction
Nel seguente protocollo, descriviamo un metodo conveniente per visualizzare la segregazione cromosomica e mitotica progressione durante il ciclo cellulare in fibroblasti embrionali del mouse utilizzando istone 2B-GFP, BacMam 2.0 etichettatura e live cell imaging.
I checkpoint di controllo del ciclo cellulare monitorare la segregazione del cromosoma e svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell’integrità genetica delle cellule 1,2,3. Accumulo di mis-segregati cromosomi può portare a aneuploide, che è un segno dei più solidi tumori 4. Quindi, rilevamento di in ritardo cromosomi utilizzabile come un metodo per studiare l’instabilità cromosomica.
L’etichetta fluorescente proteine possono essere utilizzato per visualizzare la segregazione del cromosoma dal vivo e cromosomiche in ritardo ma la generazione di mCherry-etichetta o proteina H2B-GFP etichettate richiede conoscenza sostanza di gene consegna e biologia molecolare 5. Qui descriviamo l’uso del reagente CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, chiamato in seguito reggente di CL-HB, per ragioni di semplicità. Questo reagente può essere utilizzato immediatamente e quindi Elimina le preoccupazioni circa la qualità di vettore e l’integrità. Inoltre, questo reagente non richiede l’uso di trattamenti potenzialmente dannosi o di lipidi e di tintura-caricamento prodotti chimici. A differenza di etichette fluorescenti convenzionali, il reggente di CL-HB macchie indipendentemente dalla funzione (cioè., potenziale di membrana). Il reggente di CL-HB può essere semplicemente aggiunti alle cellule e incubato durante la notte per l’espressione della proteina. Il reggente di CL-HB non replica in cellule di mammiferi e può essere utilizzato nelle regolazioni del laboratorio 1 (BSL) livelli di biosicurezza. Inoltre, la trasfezione transiente può essere rilevata dopo incubazione overnight per fino a 5 giorni, tempo sufficiente per svolgere analisi cellulari più dinamiche.
In alternativa, le anomalie cromosomiche potrebbero essere studiate mediante varie tecniche quali la citometria a flusso, immunohistochemistry o fluorescenza in situ di ibridazione (pesce) 6. Citometria a flusso può essere utilizzato per studiare l’aneuploidia, che può essere misurato basato sul contenuto del DNA e la fase delle cellule nel ciclo cellulare. Anche se la citometria a flusso può essere utilizzato per misurare l’aneuploidia, non fornisce informazioni sulla mis segregazione cromosomica. Tecniche di immunoistochimica e pesce utilizzano sonde fluorescenti per associare al DNA o cromosomi. Mentre queste tecniche forniscono un’istantanea dello stato di una popolazione di cellule, non consentono live cell imaging quindi manca qualsiasi informazione ottenuta attraverso la visualizzazione spaziotemporali della citochinesi in cellule specifiche seguiti per un periodo di tempo.
Questo protocollo è stato usato per studiare i cromosomi in ritardo o mis-segregazione cromosomica in fibroblasti embrionali del mouse di nocodazole trattati (MEFs) isolate da topi-B56γ-PP2A. In aggiunta ai sopra applicazione, questo protocollo fornisce un semplice strumento per etichettare e visualizzare segregazione cromosomica in vari tipi di cellule che può essere usato per studiare la regolazione del ciclo cellulare o instabilità cromosomica in cellule del tumore. Inoltre, può essere utilizzato anche per studiare l’instabilità cromosomica causata da vari trattamenti farmacologici o per studiare gli effetti di gene knock out conseguente mis segregazione cromosomica.
Protocol
Representative Results
Discussion
I checkpoint di controllo del ciclo cellulare che assicurano la segregazione del cromosoma accurata prevenire aneuploidia e cella trasformazione 1,2,3. Nello studio presente, abbiamo trovato che l’inattivazione di PP2A-B56γ ha provocato un checkpoint di montaggio mandrino indebolito. Live cell imaging ci ha permesso di osservare la mis-segregazione cromosomica durante la mitosi in MEFs di PP2A-B56γ trattati con nocodazole <sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Guo-Sabrina Hung e Dr. Bharatkumar Joshi per i preziosi commenti che il manoscritto è migliorato.
Materials
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
Referências
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