Ottimizzare l'utilizzo di un Robot di manipolazione liquido per condurre un alto Throughput avanti chimica genetica schermo di Arabidopsis thaliana
Summary
Una schermata di throughput elevato di piccole molecole sintetiche è stato condotto su specie modello, Arabidopsis thaliana. Questo protocollo, sviluppato per un robot di manipolazione dei liquidi, aumenta la velocità degli schermi genetica chimica avanti, accelerando la scoperta di nuove molecole piccole che riguardano la fisiologia vegetale.
Abstract
Genetica chimica sempre più è stata impiegata per decodificare tratti in piante che possono essere recalcitranti alla tradizionale genetica a causa della ridondanza genica o letalità. Tuttavia, la probabilità di una piccola molecola sintetica essendo bioactive è bassa; di conseguenza, migliaia di molecole dovrà essere testati al fine di trovare quelli di interesse. Gestione robotica sistemi sono progettati per gestire un numero elevato di campioni, aumentando la velocità con cui una biblioteca chimica può essere proiettata oltre a minimizzare/standardizzazione errore di liquidi. Per ottenere una schermata di alto-rendimento avanti genetica chimica di una biblioteca di 50.000 piccole molecole su Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolli usando un liquido multicanale banco manipolazione robot sono stati sviluppati che richiedono minima coinvolgimento tecnico. Con questi protocolli, 3.271 piccole molecole sono state scoperte che ha causato alterazioni fenotipiche visibile. 1.563 composti indotto brevi radici, 1.148 composti alterate colorazione, 383 composti causati radice dei capelli e altre, non categorizzata, alterazioni e germinazione 177 composti hanno inibiti.
Introduction
Negli ultimi 20 anni i ricercatori nel campo della biologia vegetale hanno compiuto grandi progressi utilizzando approcci di genetica chimica, sia avanti e indietro, migliorando la nostra comprensione della biosintesi della parete cellulare, il citoscheletro, la biosintesi dell’ormone e di segnalazione, gravitropismo, patogenesi, biosintesi delle purine ed endomembrane traffico1,2,3,4,5. L’impiego di tecniche di genetica chimica in avanti permettendo l’identificazione di fenotipi di interesse e permette ai ricercatori di capire i fondamenti genotipici di particolari processi. Al contrario, genetica chimica inversa Cerca prodotti chimici che interagiscono con un pre-determinata proteina bersaglio6. Arabidopsis è stato all’avanguardia di queste scoperte in biologia vegetale, perché il suo genoma è piccolo, mappato e annotati. Ha un tempo di generazione breve, e sono presenti più righe di mutante/reporter disponibili per facilitare l’identificazione di macchinari subcellulare aberrante7.
Ci sono due principali colli di bottiglia che rallentano i progressi degli schermi genetici chimici in avanti, l’iniziale processo di screening e determinare l’obiettivo del composto di interesse8. Un aiuto importante nell’aumentare la velocità di selezione piccola molecola è l’uso di apparecchiatura automatizzata9e automazione. Robot di manipolazione dei liquidi sono un ottimo strumento per la gestione delle grandi biblioteche di piccole molecole e hanno contribuito a guidare il progresso nelle scienze biologiche10. Il protocollo qui presentato è stato progettato per alleviare il collo di bottiglia associato con il processo di screening, che consentano l’identificazione di piccole molecole bioattive a ritmo veloce. Questa tecnica riduce il carico di lavoro e il tempo per conto dell’operatore, anche diminuendo il costo economico per il ricercatore di principio.
Finora, le librerie più chimiche analizzate hanno tenuto tra 10.000 e 20.000 composti, alcuni con oltre 150.000 ed alcuni con minor come 709,11,12,13,14, 15 , 16. il protocollo introdotto nel presente documento è stato implementato su una libreria piccola molecola di 50.000 composti (Vedi Tabella materiali), uno della più grande genetica chimica avanti schermi condotti su Arabidopsis fino ad oggi. Questo protocollo si adatta con l’attuale tendenza verso una maggiore efficienza e velocità per quanto riguarda la genetica chimica in avanti, soprattutto per quanto riguarda erbicida scoperta, scoperta di insetticida, fungicida scoprire, drug discovery e biologia del cancro17 ,18,19,20,21. Anche se qui implementato con Arabidopsis, questo protocollo, potrebbe facilmente essere adattato alle colture cellulari, spore e potenzialmente anche gli insetti in mezzo liquido all’interno di 96, 384- o 1536 pozzetti. Grazie alle sue piccole dimensioni, Arabidopsis è favorevole alla proiezione a 96 pozzetti. Tuttavia, distribuendo uniformemente tra pozzi è una sfida. Mano il seeding è accurata, ma ad alta intensità di manodopera, e anche se ci sono dispositivi progettati per erogare semi in piastre da 96 pozzetti, essi sono costosi da acquistare. Qui, ci mostrano come questo passaggio può essere aggirato con solo una piccola perdita in precisione.
L’obiettivo generale di questo metodo era per fare lo screening di una grande biblioteca chimica contro Arabidopsis più gestibile, senza compromettere la precisione, tramite l’utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi. L’utilizzo di questo metodo migliora l’efficienza del ricercatore di diminuire il tempo necessario per completare la gestione di serie di diluizione iniziale e schermate successive fenotipiche, consentendo una visualizzazione rapida dei campioni sotto un microscopio per dissezione e rapida identificazione di nuove piccole molecole bioattive. Figura 1 illustra i risultati chiave di questo protocollo in 4 passi.
Figura 1: flusso di lavoro complessivo dello schermo in avanti genetica chimica. Una panoramica del protocollo per essere descritto con qualche dettaglio per ciascuno dei 4 passaggi chiave. 1: ricevendo la biblioteca chimica, 2: rendere la libreria di diluizione, 3: rendendo le piastre di Screening e 4: incubazione e visualizzare le piastre di Screening. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è progettato per aiutare i ricercatori nella realizzazione di uno schermo in avanti genetica chimica su Arabidopsis. Forniamo risultati rappresentativi da uno schermo di 50.000 composti (Figura 2 e Figura 3), uno dei più grandi schermi avanti genetica chimica eseguita su Arabidopsis ad oggi9,13,23. L’utilizzo di un robot di manipolazione dei liquidi …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Jozsef cicogna, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez per la discussione costruttiva e critica. Dr. Sharyn Perry per le fotografie fenotipiche. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto cooperativa contratto n. 1355438.
Materials
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
Referências
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