مقايسة ميكرواري البروتين "تحديد المصلية" محددة مستضد "الضد الردود التالية" المطثيّة العسيرة الإصابة

Summary

توضح هذه المقالة طريقة ميكرواري بروتين بسيطة للتنميط خلطيه الاستجابات المناعية للوحة 7-من نوع plex للغاية تنقية المستضدات المطثيّة العسيرة في الأمصال البشرية. ويمكن تمديد البروتوكول لتحديد استجابات جسم معين في الأعمال التحضيرية الغلوبولين المناعي الوريدي [بولكلونل].

Abstract

نحن نقدم عرضاً مفصلاً للمقايسة ميكرواري رواية الفائق البروتين للبت في مكافحة مستويات الأجسام المضادةالمطثيّة العسيرة في الأمصال البشرية وفي الأعمال التحضيرية منفصلة [بولكلونل] الغلوبولين المناعي الوريدي (IVIg). البروتوكول يصف الخطوات المنهجية المتبعة في إعداد عينة، وطباعة صفائف وإجراء الفحص، وتحليل البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة تطوير هذا البروتوكول لتدرج عينات سريرية مختلفة بما في ذلك البلازما والخلايا supernatants ثقافة. علينا إظهار كيف يمكن استخدام ميكرواري البروتين لتحديد مزيج من ايستب (IgG, IgA, IgM)، فئة فرعية (IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، IgA1، IgA2)، والأجسام المضادة سلالة محددة للغاية تنقية كله جيم السموم A و B (توكسينوتيبي 0، سلالة VPI 10463، ريبوتيبي 087)، السمية ب من جيم ب السم فقط–وإذ يعرب عن سلالة (ككوج 20309)، ونموذج سلائف جزء ب السم ثنائي، بكدتب، ريبوتيبي-الخاصة بالطبقة السطحية أسرة البروتينات (التخاطب؛ 001، 002، 027)، والتحكم بالبروتينات (التيتانوس توكسيد والمبيضات البيض). وخلال التجربة، يتم سبر [ميكروارس] مع الأمصال من الأفراد مع الأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) دون الإسهال، ضوابط صحية (المفوض السامي)، جيم العدوى (الهيئة)، ومن قبل الأفراد والعلاج IVIg وظيفة علاج اضطراب نقص المناعة المشترك، مجتمعية وبوليراديكولوباثي دملينتينغ التهاب مزمن. أننا نواجه اختلافات كبيرة في بلغت تحييد السم ومستويات محددة من جسم ايستب متعددة بين مجموعات المرضى، التحضيرات التجارية IVIg، والأمصال قبل ويلي IVIg الإدارة. أيضا، هناك ارتباط كبير بين ميكرواري والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا) لمستويات مفتش الترياق في عينات مصل الدم. هذه النتائج تشير إلى أن ميكرواري يمكن أن تصبح أداة واعدة للتنميط الردود الأجسام المضادة على المستضدات C.difficile في البشر جرى تطعيمهم أو المصابة. مع مزيد من الصقل مستضد الألواح وتخفيض تكاليف الإنتاج، ونحن نتوقع أن التكنولوجيا ميكرواري قد تساعد في تحسين وتحديد إيمونوثيرابيس أكثر سريرياً مفيدة للعدوى جيم بصورة خاصة بالمريض.

Introduction

ويصف هذا البروتوكول التنمية والمصادقة مقايسة ميكرواري البروتين رواية ومخصصة للكشف عن وشبه الكمي للسلالة البكتيرية واستجابات جسم ايستب محددة إلى المستضدات جيم . نستخدمها بنجاح أعمالنا جيم-مقايسة ميكرواري محددة كأداة جديدة واعدة للتحاليل الطبية التركيبية لمحتوى جسم معين في الأمصال المريض^1،2، الأعمال التحضيرية IVIg³، و تحديد خصائص الأجسام المضادة ترتبط بنتائج سيئة في الهيئة⁴. نظهر كيف يمكن تحليل عينات مصلية بيوبانكيد والتحضيرات التجارية من IVIg على شرائح ميكرواري، والسماح للتنميط استنساخه عالية الجودة للردود الخاصة بمسببات المرض جسم جيم في هذا التحليل.

كثير من الأطفال الأصحاء والبالغين قد أضداد المصل يمكن كشفها IgG و IgA للسموم جيم أ وب^5،6. هذه يعتقد أن تنشأ في أعقاب التعرض عابر خلال مرحلة الرضاعة وعقب التعرض جيم في مرحلة البلوغ. لهذا السبب، فقد كان IVIg [بولكلونل] يستخدم خارج التسمية لعلاج المتكررة ومداهم ديمقراطيي^7،،من⁸⁹. ومع ذلك، لها دور حاسم وطريقة العمل لا يزال غير واضح. لقد بينت دراسات عديدة أن استجابة مناعية خلطيه للسموم جيم يلعب دوراً في عرض المرض ونتائجه. على وجه التحديد، تظهر أعراض المرضى بمصل زيادة السمية المضادة “مفتش” تركيز مقارنة بالمرضى الذين يصابون بأعراض مرض¹⁰. ذكر ارتباط يمكن إثباته لمتوسط السمية لمكافحة “ألف مفتش” التتر و 30 يوما جميع أسباب وفيات¹¹. كشفت عدة تقارير أيضا عن اقتران مع حماية ضد الردود التكرار والأجسام المضادة للسم أ وب عدة مولدات المضادات غير السمية (Cwp66، Cwp84، FliC، فليد، والبروتينات الطبقة السطحية (SLPs))^{12،13 , 14 , 15}-هذه الملاحظات قد حفزت تطوير أول المناعي السلبي المخدرات تستهدف جيم السم ب (بيزلوتوكسوماب)، الذي أقرته مؤخرا لنا الغذاء والدواء والأدوية الأوروبية الوكالة لمنع التدخلات المتكررة¹⁶. استراتيجيات التطعيم باستخدام السموم المعطل أو الشظايا السمية المؤتلف، أيضا قيد التنمية^17،،من¹⁸¹⁹. لا شك في أن تحفز هذه النهج العلاجية الجديدة الحاجة إلى تقييم الاستجابات المناعية خلطيه لمولدات المضادات المتعددة في العينات ذات الأحجام الكبيرة.

واليوم، هناك نقص ملحوظ في المتاحة تجارياً الفائق فحوصات قادرة في نفس الوقت تقييم السلالة البكتيرية واستجابات جسم ايستب محددة إلى المستضدات جيم . وهناك حاجة غير ملباة لتطوير مثل هذه الاختبارات لتيسير جهود البحث في المستقبل والتطبيقات السريرية. [ميكروارس] البروتين هي أسلوب لشل أعدادا كبيرة من البروتينات تنقية منفردة كمجموعة منظمة مكانياً من البقع على سطح المستندة إلى شريحة مجهرية باستخدام نظام روبوتية، التي يمكن أن تكون²⁰ جهة اتصال أو عدم الاتصال طباعة أداة²¹. وقد تمثل البقع الخلائط المعقدة مثل ليساتيس خلية أو الأجسام المضادة، هوموجيناتيس الأنسجة، والبروتينات الذاتية أو المؤتلف أو الببتيدات، وسوائل الجسم أو المخدرات^22،23.

بروتين ميكرواري التكنولوجيا يوفر مزايا متميزة أكثر من أليسا الداخلية القياسية التقنيات التي استخدمت تقليديا لتقييم مكافحة–جيم جسم الردود. وتشمل هذه زيادة قدرة على الكشف عن مجموعة من الأجسام المضادة المتعددة-ايستب-محددة ضد فريق أوسع من أهداف البروتين، وانخفاض حجم الاحتياجات لمولدات المضادات، والعينات، والمواد الكاشفة، وتعزيز قدرة على إدماج أكبر عدد replicates التقنية، بالإضافة إلى مراقبة الجودة الداخلية متعددة (QC) تدابير¹. وهي بالتالي أكثر حساسية ودقة واستنساخه [ميكروارس] أكبر مجموعة ديناميكية. وهذه العوامل تجعل [ميكروارس] بديلاً أرخص ويحتمل أن تكون مواتية الساس لكشف البروتينات المعروفة على نطاق واسع. ومع ذلك، يؤدي مساوئ التكنولوجيا ميكرواري أساسا من التكاليف الأولية الكبيرة المرتبطة بإنشاء فريق مستضدات تنقية عالية وإعداد منصة تكنولوجية.

بروتين [ميكروارس] وقد استخدمت على نطاق واسع على مدى العقدين الماضيين كأداة تشخيصية والأساسية لبحث في التطبيقات السريرية. تطبيقات محددة تشمل التعبير البروتين التنميط، ودراسة العلاقات إنزيم الركازة، فحص العلامات البيولوجية، وتحليل التفاعلات بين الميكروبات والمضيف، والتنميط جسم خصوصية^{23،24، 2526،،،}من²⁷²⁸. [ميكروارس البروتين/مستضد العديد من جديد الممرض في] قد أنشئت، بما في ذلك الملاريا (المنجلية)²⁹، وفيروس نقص المناعة البشرية-1³⁰،³¹من الإنفلونزا، مرض الالتهاب الرئوي الحاد (السارس)³²، الحمى النزفية الفيروسية³³ ، هيربيسفيروسيس³⁴و³⁵من السل.

يتصل هذا البروتوكول بإنشاء سهولة التشغيل جيم. صعب مستضد رد الفعل ميكرواري المقايسة، الذي يمكن القياس الكمي دقيقة ودقيقة ومحددة متعددة-ايستب والردود الخاصة بسلالة جسم إلى جيم صعب مولدات المضادات في الأمصال و IVIg [بولكلونل]. هنا، نحن تشمل الممثل نتائج تتصل أداء الإنزيم ميكرواري مقبولة بالمقارنة مع أليسا، فضلا عن دقة التحليل وإمكانية تكرار نتائج التشكيلات الجانبية. هذا التحليل يمكن زيادة تطويرها للشخصية الأخرى العينات السريرية، ويضع معايير جديدة للبحث في الأساس الجزيئي للهيئة.

Protocol

1-إعداد لوحة ميكرواري تمييع المستضدات جيم مع المخزن مؤقت طباعة [برنامج تلفزيوني-توين-تريهالوسي (50 مم)] في تركيز المثلى (التي كانت مسبقاً قبل تشغيل الأمصال المريض): السم (200 ميكروغرام/مل)، والسمية ب (100 ميكروغرام/مل)، بكدتب (200 ميكروغرام/مل)، وتنقية أصلي التخاطب كلها مستمدة من ريبوتيبي…

Representative Results

يوضح الشكل 1 المخطط انسيابي تصف الخطوات الرئيسية في بروتوكول وصف. ويبين الشكل 2 اختبارات ارتباط سبيرمان مما يدل على اتفاق كبيرة بين ميكرواري واليسا ل IgG و IgA المضادة السم أ وب المستويات في الأمصال اختبار المريض. ويبين الشكل 3…

Discussion

في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا ذلك ميكرواري منصة مناسبة لتحديد الاستجابات المناعية خلطيه جيم البروتين المستضدات في الأمصال المريض (الشكلان 3 و 6) والتحضيرات التجارية من IVIg (الشكل 5). وقد أثبتنا أيضا أن تقنية ميكرواري أداء جيدا بالمقارنة مع أليسا التقل?…

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A