En Protein Microarray analysen for serologisk fastsettelse av Antigen-spesifikke antistoffer svar følgende Clostridium difficile infeksjon

Summary

Denne artikkelen beskriver en enkel protein microarray metode for profilering humoral immunreaksjoner til et 7-plex panel av svært renset Clostridium difficile antigener i menneskelig sera. Protokollen kan utvides for fastsettelse av spesifikt antistoff svar i forberedelsene til polyklonale intravenøs immunglobulin.

Abstract

Vi gir en detaljert oversikt over en roman høy gjennomstrømming protein microarray analysen for fastsettelse av anti –Clostridium difficile antistoff nivåer i menneskelig sera og i separate forberedelser av polyklonale intravenøs immunglobulin (IVIg). Protokollen beskriver metodologiske trinnene involvert i prøven forberedelse, utskrift av matriser, analysen prosedyre og dataanalyse. I tillegg kan denne protokollen bli ytterligere utviklet å innlemme forskjellige kliniske prøver inkludert plasma og celle kultur supernatants. Vi viser hvordan protein microarray kan brukes til å angi en kombinasjon av isotype (IgG, IgA, IgM), underklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) og stammen spesifikke antistoffer mot svært renset hele C. difficile giftstoffer A og B (toxinotype 0, belastning VPI 10463, ribotype 087), gift B fra en C. difficile gift-B-bare uttrykke belastning (CCUG 20309), en forløper form for et B-fragment av binære gift, pCDTb, ribotype-spesifikke hele overflatelaget proteiner (SLPs; 001, 002, 027), og kontrollere proteiner (stivkrampe toxoid og Candida albicans). Under eksperimentet microarrays er analysert med sera fra personer med C. difficile infeksjon (CDI), personer med cystisk fibrose (CF) uten diaré, sunn kontroller (HC), og enkeltpersoner pre og post-IVIg terapi for den behandling av CDI kombinert immunsvikt lidelse og kronisk inflammatorisk demyeliniserende polyradiculopathy. Vi møter betydelige forskjeller i gift nøytralisering efficacies og multi-isotype spesifikt antistoff nivåer mellom pasient grupper, kommersielle preparater av IVIg, og sera før og etter IVIg administrasjon. Også er det en signifikant sammenheng mellom microarray og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) for Motgiften IgG nivåer i serumprøver. Disse resultatene tyder på at microarray kan bli et lovende verktøy for profilering antistoff Svar å C.difficile antigener i vaccinated eller infiserte mennesker. Med ytterligere raffinement av antigen paneler og en reduksjon i produksjonskostnadene forventer vi at microarray teknologi kan hjelpe optimalisere og velg de mest klinisk nyttig immunotherapies for C. difficile infeksjon i en pasient-spesifikk måte.

Introduction

Denne protokollen beskriver utvikling og validering av en roman og tilpassede protein microarray analysen for påvisning og semi kvantifisering av bakteriell belastning og isotype-spesifikke antistoffer Svar å C. difficile antigener. Vi kunne bruke våre C. difficile-spesifikke microarray analysen som et lovende nytt verktøy for den kompositoriske bioanalysis spesifikt antistoff innhold i pasienten sera^1,2, forberedelser av IVIg³, og Identifikasjon av antistoff særegenheter som samsvarer med dårlige resultater i CDI⁴. Vi viser hvordan biobanked serumprøver og kommersielle preparater av IVIg kan analyseres på microarray lysbilder, slik at høy kvalitet reproduserbar profilering av C. difficile patogen-spesifikke antistoffer svar i denne analysen.

Mange friske barn og voksne har synlig serum IgG og IgA antistoffer mot C. difficile giftstoffer A og B^5,6. Dette antas å oppstå etter forbigående eksponering under barndom og etter eksponering for C. difficile i voksen alder. Derfor polyklonale IVIg har vært brukt av etiketter til å behandle både tilbakevendende og fulminant CDI^7,8,9. Sin definitive rolle og virkemåte er imidlertid uklart. Flere studier har vist at humoral immunrespons for C. difficile giftstoffer spiller en rolle i sykdom presentasjon og utfallet. Spesielt viser asymptomatisk pasienter en økt serum anti-gift A IgG konsentrasjon sammenlignet med pasienter som utvikler symptomatisk sykdom¹⁰. En påviselig forening er rapportert for median anti-gift A IgG titers og 30-dagers helt forårsake dødelighet¹¹. Flere rapporter har også avdekket en tilknytning til beskyttelse mot regelmessighet og antistoff Svar å toksin A, B og flere ikke-toksin antigener (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD og overflatelag proteiner (SLPs))^{12,13 , 14 , 15}. disse observasjonene har påvirket utviklingen av første passiv immunterapi narkotika målretting C. difficile giften B (bezlotuxumab), som er nylig godkjent av US Food, Drug Administration og europeiske legemidler Kontoret for forebygging av tilbakevendende CDI¹⁶. Vaksinasjon strategies bruke deaktivert giftstoffer eller rekombinante gift fragmenter er også under utvikling^17,18,19. Disse nye terapeutiske metoder vil utvilsomt stimulere behovet for evaluering av humoral immunreaksjoner mot flere antigener i store utvalgene.

I dag, er det en betydelig mangel av kommersielt tilgjengelig høy gjennomstrømming analyser kan samtidig vurdere bakterielle belastningen og isotype-spesifikke antistoffer Svar å C. difficile antigener. Det er et udekket behov for å utvikle slike analyser for å lette fremtidig forskningsinnsats og kliniske applikasjoner. Protein microarrays er en metode for å nakkens stort antall individuelt renset proteiner som en romlig organisert rekke flekker på en mikroskopisk lysbilde-baserte overflate ved hjelp av en robot-system, som kan være enten en kontakt²⁰ eller en ikke-kontakt utskrift verktøyet²¹. Flekker kan representere komplekse blandinger som celle lysates, antistoffer, vev homogenates, endogen eller rekombinante proteiner eller peptider, kroppsvæsker eller narkotika^22,23.

Protein microarray teknologi gir forskjellige fordeler over standard in-house ELISA teknikker, som har tradisjonelt blitt brukt til å vurdere anti –C. difficile antistoff svar. Disse inkluderer en økt kapasitet for å oppdage en rekke multi-isotype-spesifikke antistoffer mot et mer omfattende panel av protein mål, redusert volumkrav til antigener, eksempler og reagenser, og en forbedret evne til å inkludere en større antall tekniske gjentak, i tillegg til flere interne kvalitetskontroll (QC) måler¹. Microarrays har derfor mer følsomme og nøyaktige reproduserbare og et større dynamisk område. Disse faktorene gjør microarrays en billigere og potensielt gunstig alternativ til ELISAs for store påvisning av kjente proteiner. Men ulempene microarray teknologi føre hovedsakelig fra store forhånd kostnadene forbundet med å etablere et panel av høyrenset antigener og sette opp den teknologisk plattformen.

Protein microarrays har blitt brukt de siste to tiårene som en diagnostisk og grunnleggende forskningsverktøy i kliniske applikasjoner. Bestemte programmer inkluderer protein uttrykk profilering, studiet av enzym-underlaget relasjoner, biomarkør screening, analyse av vert-mikrobe interaksjoner, og profilering antistoff spesifisitet^{23,24, 25,26,27,28}. Mange nye patogen protein/antigen microarrays er etablert, inkludert malaria (Plasmodium)²⁹, HIV-1³⁰, influensa³¹, alvorlig akutt åndedretts syndrom (SARS)³², viral hemoragisk feber³³ , herpesviruses³⁴og tuberkulose³⁵.

Nåværende protokollen gjelder etableringen av en enkel drift C. difficile reaktive antigen microarray analysen, som muliggjør nøyaktig, presis og spesifikk kvantifisering av multi-isotype og stammen spesifikke antistoffer svar på C. difficile antigener i sera og polyklonale IVIg. Her, inkludere vi representant resultatene gjelder en akseptabel microarray analysen ytelse i forhold til ELISA samt analysen presisjon og reproduserbarhet profiler. Denne analysen kan utvikles profilen andre kliniske prøver og setter en ny standard for forskning i molekylær grunnlaget for CDI.

Protocol

1. klargjør en Microarray Plate Fortynne C. difficile antigener med en utskrift buffer [PBS-Tween-trehalose (50 mM)] på optimal konsentrasjon (som var forhåndsdefinerte før pasienten sera): gift en (200 µg/mL) og gift B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), og renset innfødt hele SLPs avledet fra ribotypes 001 og 002 027 (200 µg/mL).Merk: Gift B er Hentet fra en gift B-uttrykke belastning CCUG 20309 (90 µg/mL). Fortynne positiv kontrollene, lysates C. albicansog stivkrampe toxo…

Representative Results

Figur 1 illustrerer et flytskjema som beskriver de viktigste trinnene i beskrevet protokollen. Figur 2 viser Spearman korrelasjon tester viser betydelig avtale mellom microarray og ELISA for IgG og IgA anti-gift A og B nivåer i pasienten test sera. Figur 3 viser differensial IgG og IgA antistoff-klassen spesifikt antistoff Svar å toksin A, gift B og binære gift (pCDTb) i pasienter med CF uten diar…

Discussion

I denne protokollen, har vi vist at microarray er en passende plattform for definere humoral immunreaksjoner til C. difficile protein antigener i pasienten sera (tall 3 og 6) og kommersielle forberedelser av IVIg (figur 5). Vi har også vist at microarray teknikk utfører også sammenlignet med konvensjonelle ELISA (figur 2) og viser utmerket reproduserbarhet, intra – og inter – assay variabilities innenfor akseptable g…

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A