Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna
Summary
Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.
Abstract
La evaluación de las vacunas de subunidad moderna revela que la generación de anticuerpos neutralizantes es importante pero no suficiente para la selección del adyuvante. Por lo tanto, están urgente adyuvantes con capacidades inmuno-estimuladora humorales y celulares que son capaces de promover respuestas citotóxicas de los linfocitos (CTL) T. Así, el fiel seguimiento de candidatos de adyuvante que inducen reactividad cruzada y posteriormente aumentar la generación de CTL representa un paso crucial en el desarrollo de una vacuna. Aquí presentamos una aplicación de un método que utiliza SIINFEKL específicos (OT-I) las células T para controlar la presentación cruzada del modelo antígeno ovoalbúmina (OVA) en vivo en la presencia de candidatos de diferentes adyuvantes. Este método representa una prueba rápida para seleccionar adyuvantes con las mejores capacidades de reactividad cruzada. La proliferación de CD8+ T las células es la más valiosa indicación de reactividad cruzada y también es considerado como un correlato de presentación cruzada inducida por adyuvante. Esta característica puede ser evaluada en diversos órganos inmunes como los ganglios linfáticos y el bazo. También puede supervisar el grado de la generación de CTL, que dando ideas sobre la naturaleza de un local (nodo de linfa de drenaje principalmente) o una respuesta sistémica (distante de los ganglios linfáticos o bazo). Esta técnica además permite múltiples modificaciones para probar fármacos que pueden inhibir vías específicas de presentación cruzada y también ofrece la posibilidad de ser utilizado en diferentes cepas de ratones modificados genéticamente y convencionales. En Resumen, la aplicación que presentamos aquí será útil para los laboratorios de la vacuna en la industria o la academia que desarrollaran o modificar químicos adyuvantes de la vacuna investigación y desarrollo.
Introduction
Los linfocitos T citotóxicos (CTL) que las vacunas son fundamentales intervenciones terapéuticas que se han desarrollado para luchar contra a ciertos tipos de cáncer1. También son importantes las vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares2CTL. Por otra parte, CTL son uno de los pocos mecanismos de defensa inmunes funcionalmente activos en poblaciones de riesgo como neonatos3,4 quien también dependen de CTL para luchar contra la temprana vida infecciones5. En este sentido, las vacunas contra el Virus sincitial respiratorio (VSR) que fueron desarrolladas con un adyuvante que no provocan respuestas CTL (alumbre) resultaron en un fracaso de la vacuna lleva a serias complicaciones con infecciones en recién nacidos6. Estos efectos negativos de la vacunación pueden invertirse por una CD8+ de respuesta de la célula de T7. Previamente hemos demostrado que las citoquinas principales (tipo interferones de I) sacadas por algún estimulador de agonistas (aguijón) los genes de interferón son esenciales para las respuestas CTL generadas por estos adyuvantes8, en parte por la medición de la proliferación de OT-I T las células después de la vacunación y usar estos resultados como una medida de CTL inducen las capacidades observadas en extendieron vacunación horarios9. La medición de la proliferación de OT-I CD8+ T las células en un ratón receptor de tipo salvaje (WT) C57BL/6 por carboxyfluorescein succinimidyl tinte de éster (CFSE) dilución es una estimación robusta de la capacidad de los adyuvantes de una vacuna para generar reactividad cruzada de SIINFEKL, (el péptido inmuno-dominante de ovoalbúmina, óvulos). Variaciones de esta técnica están ampliamente utilizadas para la evaluación de la proliferación de OT-I CD8+ y OT II CD4+ T las células. Por ejemplo, se ha utilizado en la ausencia de las citoquinas (ratones KO) o para medir la eficacia de la vacuna después de memoria del antígeno en animales de peso. Ideamos un protocolo corto (4 días experimento) en el que después de la transferencia pasiva de OT CFSE-manchado-I CD8 células+ T, una vacunación subcutánea de (s.c.) que consiste en una dosis de 50 μg de huevos libres de endotoxinas complementado con adyuvantes de la prueba se administra (Figura 1). El seguimiento de los resultados 48 horas después de la vacunación proporciona una prueba confiable de la capacidad de los adyuvantes para generar respuestas CTL. Por esta estrategia, es posible evaluar la potencia de la respuesta inmune local en el nodo de linfa de drenaje después de la inmunización, así como la magnitud de la respuesta mediante la medición de la actividad CTL en el bazo (o los ganglios linfáticos distantes).
Protocol
Representative Results
Discussion
Las vacunas modernas son idealmente composedof antígeno purificado y adyuvantes, con la posible adición de un sistema de entrega como liposomas, virus-como partículas, nanopartículas o vectores vivos. Un aspecto clave en el diseño de una vacuna es elegir el adyuvante adecuado según las necesidades clínicas. Parte del ámbito podría implicar favoreciendo una humoral y respuesta inmune celular (o ambos), la elección de un local frente a una respuesta inmune sistémica (o ambos) y el tipo de memoria que la vacuna d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a nuestros asistentes técnicos: Bröder U. y H. Shkarlet, que nos ayudaron durante procedimientos experimentales. Este trabajo fue financiado en parte por convocatoria (UniVax, contrato no. 601738 y TRANSVAC2, contratación Nº 730964) y una donación de la Asociación Helmholtz (HAI-IDR). Las fuentes de financiación no influyó en la investigación de diseño, generación del manuscrito o la decisión de presentar para su publicación.
Materials
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
Referências
- Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
- Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
- Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
- Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
- Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
- Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
- Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
- Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
- Ebensen, T., et al. Bis-(3′,5′)-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
- Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
- Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
- Otto, K., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
- Shimizu, S., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).
- Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
- Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
- Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
- Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
- Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
- Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
- Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
- O’Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
- Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
- Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
- Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
- Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
