本协议的目的是量化在质粒 dna 上对定义的 dna 蛋白 crosslinks 的修复。损伤质粒被转染成受体哺乳动物细胞系和低分子量, 在多时间点后再染。DNA 修复动力学的量化使用链特定引伸后, qPCR。
该方法的目的是提供一个灵活, 快速, 定量的技术, 以检查 DNA 蛋白交联 (DPC) 修复哺乳动物细胞系的动力学。这项研究不是在全球范围内对 xenobiotic 诱导的或自发的染色体 DPC 去除进行检测, 而是检查在质粒 DNA 基底内的一个部位专门介绍的均匀的、化学定义的病灶的修复。重要的是, 这种方法避免了使用放射性材料, 不依赖昂贵的或高度专业化的技术。相反, 它依赖于标准的重组 DNA 程序和广泛可用的实时, 定量聚合酶链反应 (qPCR) 仪器。鉴于所采用的战略具有固有的灵活联蛋白的大小 , 以及化学联系的性质和附着地点的精确 DNA 序列上下文可以多种多样 , 以解决这些参数提高了 DPC 修复的整体效率。采用该方法, 将含有特定地点的 DPC 的质粒转染成细胞, 并在不同的时间后转化后恢复到低分子量的 DNA。恢复后的 DNA 会受到链特定的底漆延伸 (SSPE), 使用底漆补充的质粒受损的线。由于 DPC 病变阻断 Taq dna 聚合酶, 因此可以用 qPCR 定量评估修复 dna 的比例。周期门限 (CT) 值用于计算各个单元格行中不同时间点的百分比修复。这种 SSPE qPCR 方法还可用于定量地评估阻止 Taq 聚合酶的任何 DNA 加合物的修复动力学。
本文描述的是一种 pcr 检测方法, 称为 SSPE-qPCR。该方法的目的是对转染修复缺陷和精通哺乳动物细胞的质粒 DNA 的 DPC 修复进行量化。这种检测方法快速、定量、极具灵活性, 并可直接测量修复活动。虽然本报告的重点是使用这种方法来研究修复 DPCs, 下面的结果表明, 修复任何损害, 阻止 Taq 聚合酶可以研究使用这种方法。
这一方法的发展背后的基本原理是深入了解哺乳动物细胞修复 DPCs 的机制。与其他类型的 DNA 损坏不同, DPCs 具有大量不同的1、2。研究表明, 数以百计的细胞蛋白可以与 DNA 交联, 对于每种蛋白质, 原则上, 许多氨基酸侧链可能成为共价键附着在细胞 DNA3。此外, 有许多化学附着点的蛋白质到 DNA 主干, 包括几个位置上的核苷酸基地以及在核糖糖4,5。这种化学多样性使人们有可能依靠不同的生物化学途径来修复不同类型的 DPCs。考虑到这一问题, SSPE-qPCR 的测定被开发出来了。
为了深入了解细胞 DPC 修复的分子生物学, 开发了几种技术。下面概述了已开发的主要方法, 并总结了各自拥有的主要长处和弱点。值得强调的是, 虽然本综述的重点是在哺乳动物细胞培养系统中 dpc 修复的研究, 但对目前的 dpc 修复模型作出了重大贡献, 使用的微生物和无细胞系统, 在本手稿.
也许, 可以采取最简单的策略, 以了解 DPC 修复的遗传学是评估各自对细胞死亡的敏感性观察野生类型和突变细胞暴露在诱导 DPCs6,7。这种策略相对较快, 成本低廉, 而且不需要专门的专门知识才能完成基本的细胞培养技术。制衡这些优点对此方法有许多限制, 包括以下内容。首先, 该检测不能直接测量 DNA 的修复。这一策略的工作假设是, 在编码相关 dna 修复蛋白的基因中, 失活突变会导致 dna 损伤的累积, 触发程序性细胞死亡。然而, 编码非 DNA 修复蛋白的基因突变可以在主, 增强 (或减少) 细胞对 xenobiotic 诱导的细胞死亡的敏感性。其次, 创建 DPCs 的代理总是诱发其他类型的 DNA 损伤 (一个例外是 5-aza-2 ‘-deoxycytadine, 但此代理也耗尽了细胞甲基水平8)。因此, 可以想象, 增强的细胞对该制剂的过敏反应可能反映修复 interstrand crosslinks 或其他病变的缺陷。第三, 如上所述, DPCs 代表了一个巨大的异构类组成的不同类型的化学 crosslinks, 涉及不同的蛋白质合作伙伴。可能在特定的遗传背景下, 修复一个或多个子类型的病变可能会改变, 这种差异可能不足以显著改变细胞对死亡的过敏反应。总之, 虽然这一战略是一个有吸引力的出发点, 上面概述的限制强调了寻求其他更直接的方法来研究 DPC 修复动力学的重要性。
为了实现这一目标, 已经制定了若干相关的办法。例如, 调查人员已经开发出方法来区分 ‘ 自由 ‘ dna 和 ‘ 蛋白质绑定 ‘ dna9,10,11。利用这些方法, 可以比较 DPCs 的稳态水平或在不同遗传背景下暴露于 DPC 生成剂的情况下。最广泛使用的两种策略涉及使用硝化膜结合策略或氯化钾/SDS 沉淀12、13, 从游离 dna 中分离含 DPC dna。在前处理细胞是裂解和通过硝化棉过滤器。由于硝化纤维素结合蛋白质, 过滤器保留蛋白质链接的 dna, 允许游离 DNA 通过。在后一种战略中, 蛋白质绑定 dna 与游离 dna 分离, 其基础是 SDS 与蛋白质而不是 DNA 结合, 并且可以通过添加氯化钾来沉淀。因此, 蛋白质链接的 dna 变得不溶, 而未绑定的 dna 仍然在溶液中。量化的 dna 可以使用核素胸苷 (如果细胞最初新陈代谢标记) 或 dna 选择性荧光染料如赫斯特33258。这些方法是可重现的, 需要少量的步骤。然而, 它们并没有提供有关蛋白质附着在 DNA 上的化学交联性质的信息。此外, 重要的是要注意, 这些化验可能过度估计 DPC 修复的错误评分不完全修复,即, 蛋白水解处理, 以较小的 dna 肽 crosslinks, 可能不容易被捕获或沉淀, 作为真正的 DNA修复.
彗星的化验可以用来可视化 DPC 形成在细胞14。在这些实验中, DPCs 的存在减少了 DNA 的迁移, 从而可以通过对蛋白酶 K 的预处理来逆转。因此, 尾部的长度可以用来估计 DPC 的形成。然而, 如上所述, DPC 形成的药物产生其他类型的 DNA 损伤, 可能改变尾部长度。该协议还具有高度技术性, 需要在共聚焦成像方面的专门知识和培训。
质谱法可用于研究 DPC 修复动力学后的交联剂的治疗,15,16,17。这些实验用 DPC 形成剂处理细胞, 通过生物素捕获或苯酚分离 DPCs: 氯仿 (1:1) 萃取。质谱可以用来识别交联蛋白或定量 DPCs 的数量。这种方法的主要优点是生成的数据的性质。有可能精确地编目在接触到 xenobiotic 后交联的蛋白质的类型, 但是, 这个协议是昂贵的, 耗时的, 并受可检测的交叉的类型的限制。
Maizels et . 开发了一种敏感的 “雷达” (dna 加合恢复的快速方法), 用于定量 immunodetection dna 蛋白加合物, 以及一种基于 ELISA 的雷达检测18, 19.这些化验方法对于诱捕细胞中瞬时形成的 DNA 蛋白中间体和生成适合于质谱的样品来识别新的蛋白质加合物特别有用。这种 immunodetection 的检测依赖于是否有抗体来捕获 DNA 蛋白交联, 因此, 可能无法检测在修复过程中形成的降解 DNA-肽加合物。最近, 一个特定的 DPC 修复通路链接到 dna 复制和 dna 依赖金属蛋白酶斯巴达被发现, 其中 DPCs 是 proteolyzed 小肽在修复期间 20, 21.遗传突变的基因是与 Ruijs-Aalfs 综合征的人, 一种疾病的特点是基因组不稳定, 过早衰老, 和肝癌22。基因设计的斯巴达基因缺陷小鼠显示类似的表型23。
宿主细胞重新激活转录活性已被用来研究修复已转染的质粒 DNA 基板上的定义病灶24,25。在这些实验中, 含有 DPCs (或其他类型的 DNA 损伤) 的质粒, 如荧光素酶, 被转染成细胞。24-72 小时后的发光测量结果与 DPC 修复相关。然而, 这些间接的修复化验没有能力检测的修复事件早于24小时后转染, 不能区分 RNA 聚合酶旁路部分修复基底和完全修复。
上述每种方法都有其优点, 并为 DPC 修复的当前模型做出了贡献。然而, SSPE-qPCR 检测绕过了与这些其他方法相关的一些限制, 因此可以更具体地了解 DPC 修复机制。例如, SSPE-qPCR 检测可以直接测量完整哺乳动物细胞 DNA 中特定部位 DPCs 的修复。这种方法是通用的, 并已被用于获得修复结果后, 转染仓鼠和人的细胞线。在培养的哺乳动物细胞系中, 可以使用 lipofection 或电穿孔来进行质粒的转染。它还确保只测量定义的 DPCs 的修复, 而不是由大多数 DPC 形成的药物引起的其他类型的 DNA 损伤。SSPE-qPCR 易于执行, 价格低廉, 速度快。结果表明, 使用该方法检测的修复事件早在2小时后转染。使用这种方法, 可能影响 DPC 修复结果的变量可以以敏感和有效的方式进行研究。例如, 转录在 DPC 修复中的作用尚未得到严格评估。由于 SSPE-qPCR 试验的灵活性, 可以对 DPC 的交联部位进行处理, 以解决这个问题。此外, 引入一个复制到 dpc 轴承质粒的起源可以用来解决复制对 dpc 修复的影响。此外, 可以在质粒上创建多个 crosslinks, 以检查单个 DPC 与多 crosslinks 的修复差异。这些问题是很难回答使用染色体 DNA, 但可以很容易地解决使用 SSPE-qPCR 化验。总的来说, SSPE-qPCR 的检测要求纯化, 质粒 DNA 的微克数量包含一个已知位置的损害。加合物除 DPC 外, 可用于本试验, 但是, 病变必须能够阻止 Taq 聚合酶的扩展。
SSPE-qPCR 方法通过检查含有单一的、定义的 DPC 病变的同质种群的修复, 提供了许多优于其他方法的优势。值得注意的是, 除了控制蛋白质的特性和用于将蛋白质与 DNA 连接的化学交联类型外, 还可以很容易地操作引入 DPC 损伤的序列上下文。我们已经探讨了对 DPC 修复的影响, 介绍了在模板或编码链的一个质粒下游的活动助剂轨迹。同样, 我们正在调查的影响, DPC 修复复制使用一个 M13 质粒, 其中含有 SV40 的复制的起源转染成 HEK293T 细胞。此处描述的检测直接测量 DPC 修复, 而不是其他策略, 如间接估计修复活动24、25的主机单元重新激活。此外, 该系统是稳健的, 敏感的和定量的。与其他测量 DPC 清除的系统不同, 此检测仅检测到完整的修复事件,即, 它不仅要求删除 DPC 病变, 而且还需要完全恢复双相 DNA 的完整性17。这是因为 abasic 的站点和磷酸二酯骨干的缺口或断裂会有效地阻止检测, 如原始 DPC病变29。
虽然本报告的重点是一种特殊类型的 DPC, 这是由硼氢化捕获的酶反应中间体, 我们目前正在开发的方法来研究修复 DPCs 涉及其他蛋白质和病变, 其中蛋白质链接到DNA 发生在核苷基上, 而不是核糖位置。使用还原胺化, 我们创造了蛋白质和肽 crosslinks 附着在鸟嘌呤或胞嘧啶基的 DNA 底漆30。这些寡核苷酸被纯化为均匀性, 用于生成含有 dna 蛋白和 dna 肽 crosslinks 的超螺旋质粒。虽然这些反应的效率相对于上文详细描述的 oxoguanine glycosylase 交联方法有所减少, 但它们是成功的, 并允许在野生型的情况下检查这些基底的修复和核苷酸切除修复缺陷的哺乳动物细胞系。我们还使用了 SSPE qPCR 试验研究 oxoguanine 病变的修复和合成核糖-胆固醇共轭, 这是以前证明是通过细胞核苷酸切除修复机械31修复。正如图 2图形描述的那样, 在原则上, 用 SSPE-qPCR 检测方法来测量阻止 Taq 聚合酶引伸的任何病变。
目前的 DPC 修复模型表明, 更大的 DPCs (> 10 kDa) 在删除之前会被蛋白水解处理到更小的肽类病变 (32,33,34。最有可能的候选人负责这一蛋白水解是在人类细胞的蛋白酶体或特定的蛋白酶, 名为斯巴达20,21,35,36,37,38. 对这些蛋白酶作用的进一步调查可以使用 SSPE-qPCR 法进行。蛋白酶体抑制剂可用于预处理细胞在转染含 DPC 的基质之前。或者, 斯巴达的击倒细胞系可以被受损的质粒转染, 以阐明其在大 DPCs 的蛋白质水解中的作用。
无论使用何种方法来创建交联或 DNA 损伤的性质, 值得强调的是, SSPE-qPCR 方法是严重依赖于能够产生大量的均质的 DPC-质粒基质。这一分析的关键步骤包括纯化的共价键, 封闭圆形质粒后底漆延伸, 以消除任何缺口或线性质粒分子。必须消除这些污染物, 以确保任何后续的 DPC 修复都不是由于尼克定向或双链断裂定向修复过程。通过将寡核苷酸与单链 dna 的比值变化, 可以克服在引物延伸反应后未能获得足够数量的超螺旋 dna。SSPE-qPCR 方法的另一个重要步骤是蛋白质对质粒的交联效率。在本研究中, 一种高效的酶反应被用来将 oxoguanine glycosylase 蛋白与 8-氧鸟嘌呤的病变交联。通过改变添加到反应中的蛋白质量, 可以改善次优交联。
虽然本报告中描述的结果依赖于 lipofection 将 DPC 修复基板引入接收单元, 但没有任何理由,先验, 其他 transfections 方法无法使用。我们进行了初步研究, 并观察到电穿孔39也可以使用。然而, 值得注意的是, 在我们的经验中, 电穿孔的转染效率与 lipofection 相比降低, 我们发现除了1.5 µg 的 DPC 基板获得修复数据外, 还有必要使用载体 DNA (最多5µg)。总的来说, 上述 SSPE qPCR 方法提供了一种创新的方法, 专门检查 DPC 修复的质粒 dna, 并产生新的洞察力的 dna 损伤反应。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由国家卫生研究院 (ES023350) 资助。丽莎 Chesner 是由训练补助金5T32HL007741 支持的。我们感谢娜塔莉 Tretyakova (明尼苏达大学) 和阿希斯·南迪巴苏 (康涅狄格大学) 及其实验室成员在这项工作的早期和中期阶段提供支持和技术咨询。
8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
Taq polymerase | NEB | M0267L | |
ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
BSA | NEB | B9001S | |
T4 polymerase | NEB | M0203L | |
T4 ligase | NEB | M0202L | |
β-agarase | NEB | M0392S | |
Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
BspD1 | NEB | R0557S | |
NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |