Bağırsak hayatın Caenorhabditis elegans lizozomal Alkalinization değerlendirilmesi
Summary
Lizozomal asit pH duyarlı hayati boya 5 (6) – carboxy – 2′, 7′-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA) kullanarak C. elegans bağırsak kaybı soruşturma için bir adım adım kılavuz
Abstract
Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans (C. elegans) uzun ömür ve gelişim yolları çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeli sistemidir. Bu tür çalışmalar hayvan, ileriye ve geriye doğru genetik deneyleri, üreten fluorescently etiketli protein göreli kolaylığı ve ya erken microinjected floresan boyalar kullanımı yeteneği şeffaflık tarafından kolaylaştırdı embriyo veya hücre organelleri (örneğin phenoxazine-5-1 9-diethylamino-5 H-benzo (a) ve (3-{2-[(1H,1’H-2,2′-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} – N – etiketlemek için onun gıda (E. coli zorlanma OP50) içine dahil [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Burada, bağırsak organellerin, lekeleri floresan bir pH duyarlı boya kullanımı canlı solucanlar lizozomal asitliği dinamik, fizyolojik değişikliklerin görsel bir okuma sağlayan mevcut. Bu iletişim kuralı lizozomal pH ölçmek değil, ama oldukça fizyolojik alakalı varyasyonları lizozomal asitliği değerlendirirken, güvenilir bir yöntem kurmayı amaçlıyor. cDCFDA floresan fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorofluorescein (cDCF) hidroliz üzerine tarafından hücre içi esterazlar dönüştürülür hücre permeant bir bileşiktir. Organellerin içinde Protonation cDCF içinde nerede biriken bu organelleri yakalar. 4.8 düşük onun pKa nedeniyle, bu boya Maya bir pH sensör olarak kullanılmıştır. Burada bağırsak organellerin asitliği değerlendirmek için bir gıda takviyesi olarak cDCFDA kullanımı açıklamak C. elegans. Bu teknik canlı hayvanlar, alkalinizing organellerin tespiti için izin verir ve deneysel uygulamalar yaşlanma, autophagy ve lizozomal Biyogenez çalışmalar da dahil olmak üzere geniş bir yelpazesine sahiptir.
Introduction
Protein toplamları görünümünü yaygın bir hallmark ökaryotik hücreler1,2,3ve hangi hücresel yaşlanma4 ilke sürücüleri arasında düşünülmektedir oluşumu yaşlanma olmak kabul , 5 , 6 , 7. yaş hücreleri gibi protein katabolizma protein toplama artışa önde gelen Engelli olduğunu büyüyen kanıtıdır. Hücrelerin yaşlanma içinde proteolizis çöküşü autophagy8 yanı sıra proteasome-aracılı protein yıkımı9bir bozulma içerir. Son olarak, geri dönüşü olmayan protein oksidasyon daha fazla protein katabolizma10bozulması eski hücrelerde artar.
Autophagy başlangıçta için toplu bozulma bozuk proteinlerin non-selektif bir süreç olduğu düşünülüyordu ama son yıllarda yapılan çalışmalarda bu autophagy çok seçici protein toplamları ve işlevsel olmayan organelleri olmayan katabolizma belirttiler mükellef bozulması diğer protein izni mekanizmaları11ile için. Autophagy işlemi sırasında zarar görmüş ve toplanan proteinleri autophagosome denilen bir çift-membran vezikül münzevi. Bu autophagosome sonra da autophagosome kargo12düşmesine neden organellerin, denilen asidik organelleri ile Sigortalar. Organellerin autophagic yolun son nokta temsil ve membran tamir, transkripsiyon kontrolü ve besin algılama gibi farklı hücresel süreçler iştirak; hücresel homeostasis (ref. 13 gözden) içindeki merkezi rolü vurgulayarak. Çeşitli çalışmalarda lizozomal işlevi bir yaş bağımlı azalma ve çeşitli nörodejeneratif hastalıklar13arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Sürekli olarak, büyük hücrelerdeki lizozomal işlevi geri yükleme fenotipleri yaşlanma ile ilgili14,15başlangıçlı gecikme. İntralumen ortamın kompozisyonu çalışmalarının lizozomal büyük hücre işlevinde çöküşü lizozomal proteaz16üretim azalma nedeniyle değil öneririz. Alternatif olarak, intralysosomal asit, enzimatik faaliyet, kritik bir gereklilik kaybı lysosome-aracılı proteolizis17düşüş altında yatan önerilmiştir. Bu hipotez keşfetmek için güçlü olmak, reaktifler ve dinamik değişiklikleri canlı hücrelerdeki lizozomal pH yinelenebilir ve tutarlı bir şekilde soruşturma için protokolleri geliştirmek esastır.
C. elegans bağırsak solucanları önemli metabolik doku ve sistemik homeostazı ve ömrü kritik bir regülatör. Biz deneyleri değişikliklerini değerlendirip geliştirdik solucan nasıl lysosome-aracılı proteolizis belirlemek için bağırsak organellerin Lümen asitliği yaşlanmaya katkıda bulunur. PH-duyarlı fluorophores daha önce C. elegans içinde bağırsak organellerin işaretlemek için kullanılmıştır rağmen henüz küçük artışlar lizozomal pH vivo18‘. algılayabilir başarılı bir iletişim kuralı kurmak çabası olmadı Burada, OP50 maması pH duyarlı fluorophore (cDCFDA) içeren basit ve uygun beslenme protokolü kullanarak lizozomal asit kaybı C. elegans bağırsak hücreleri algılamak için kullanılan bir protokol sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücresel ve moleküler olayları çeşitli katkıda bulunmak için yaşlanma, yaşam öyküsü özellikleri ve genetik faktörlerden etkilenir. Bizim son çalışma22 üreme döngüsü lizozomal pH dynamics düzenlenmesi aracılığıyla soma fitness denetlenmesinde önemli bir rol oynar öneriyor. Biz hayvanlar aktif olarak sırayla asidik organellerin sağlar v-ATPaz transkripsiyon upregulation tarafından yeniden iken o lizozomal aracılı proteolizis yükseltilir gösterdi. Üreme, v-ATPaz if…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Caenorhabditis genetik Merkezi suşları, Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Vakfı için yenilik (finansmanı için CFI) teşekkür etmek istiyorum. Dr. Lizhen tüm C. elegans deneyler için onun laboratuar İmkanları sınırsız kullanımına izin veren için Chen (hücre sistemleri bölümü ve anatomi, UT sağlık San Antonio) yanı sıra Dr Exing Wang (müdür, optik görüntüleme tesis teşekkür etmek istiyorum UT sağlık San Antonio) confocal mikroskobu konusunda yardım almak için. Biz de doktor Myron Ignatius destek ve video çekimi kolaylaştırmak için cesaret verdiğiniz için teşekkür ederiz istiyorum.
Materials
| OP50 (E. coli) | Caenorhabditis Genetics Center | Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| 5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate | ThermoFisher | C369 | Commonly known as cDCFDA |
| 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron | ThermoFisher | L7528 | Commonly known as Lysotracker Red |
| Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Broth powder | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar | Sigma | A5306-1KG | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Cholesterol powder | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Microscope Slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover Slips | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarose | Sigma | A6013 | |
| Incubator | |||
| Mirror or other smooth flat surface |
Referências
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
- Cuervo, A. M., et al. Autophagy and aging: the importance of maintaining "clean" cells. Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).
- Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson’s disease. Methods. 53 (3), 220-225 (2011).
- Muchowski, P. J. Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?. Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. Age-related decline in chaperone-mediated autophagy. J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).
- Tonoki, A., et al. Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process. Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).
- Squier, T. C. Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).
- Sarkar, S., et al. Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington’s disease models. Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).
- Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
- Boya, P. Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease. Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).
- Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
- Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease. Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. How do intracellular proteolytic systems change with age?. Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).
- Cuervo, A. M., Dice, J. F. When lysosomes get old. Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).
- Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).
- Pringle, J. R., et al. Fluorescence microscopy methods for yeast. Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).
- Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans. Genética. 207 (1), 83-101 (2017).
- Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease. Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).
- Kang, H. T., et al. Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence. Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).
- Brunk, U. T., Terman, A. The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis. Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).
- Gerland, L. M., et al. Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells. Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).
- Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice. Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).
- Yin, D. Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores. Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).
- Nehrke, K. A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span. J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).
- Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function. Elife. 6, (2017).
