Summary
在这里, 我们描述了建立和培养人和老鼠衍生的3维 (3D) 胃 organoids 的协议, 以及将 3D organoids 转移到2维单层的方法。本文还介绍了用胃上皮单层作为再生研究的一种新的擦伤创面检测方法。
Abstract
体外对胃创面修复的研究通常涉及使用胃癌细胞系进行细胞增殖和迁移的刮伤试验。然而, 这种化验的一个关键限制是它们的细胞类型的同源分类。修复是一个复杂的过程, 需要几个细胞类型的相互作用。因此, 研究一种缺乏细胞亚型的文化, 是我们理解修复过程必须克服的一个问题。胃 organoid 模型可以缓解这个问题, 即细胞类型的异构收集密切反映的胃上皮或其他本机组织在体内。这里演示的是一本新颖的,体外刮伤试验, 从人或小鼠3维 organoids, 然后可以转移到胃上皮单层作为完整的 organoids 或作为一个单独的细胞悬浮分离organoids。该协议的目的是建立 organoid 的胃上皮膜, 可用于一个新的擦伤伤口检测系统, 以研究胃再生。
Introduction
使用刮伤检测是研究修复和再生的常用方法1,2,3,4,5,6。建议的方法可用于专门研究胃再生和幽门螺杆菌的殖民化。过去, 胃癌细胞系被用来研究幽门螺杆菌 (幽门螺杆菌) 感染 1,2和直到最近的胃癌细胞株, 如 AGS 细胞被青睐1 ,2,3,4。胃癌细胞培养的一个局限性是它们未能重述胃上皮细胞的多样性。为了解决这一局限性, 这里展示了一个主要的人和小鼠3维胃底胃 organoids (FGOs) 的建立和转移的胃上皮单层的伤口愈合检测的基础上改进方法由 Schlaermann et al描述。7我们演示了从剪切后的3D 胃 FGOs 或 FGO 衍生的单细胞中提取的胃上皮细胞, 保留了一种极化的蜂窝状成分, 它与胃上皮的在体内有密切的关系。鉴于胃癌细胞系并没有证明这种技术所显示的细胞组成, 目前的协议比其他的擦伤伤口检测方法有优势。这种方法已被优化, 使单分子膜可以建立从整个 organoids 或从一个单一的细胞悬浮从分离 organoids 和电镀使用基底细胞膜基质或胶原涂层。该协议的总目标是建立一个 organoid 的胃上皮单层培养的新的伤口愈合试验。
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Protocol
为了避免污染, 在无菌组织培养罩内全部执行协议。根据经批准的辛辛那提大学 irb 协议 (irb 协议号: 2015-4869), 从患者的袖状胃切除术中收集人体胃底组织。
所有老鼠的研究都得到了辛辛那提大学机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准, 它维持着美国实验室动物护理 (AAALAC) 设施的评估和认可协会。
1. 建立人源性3D 胃胃底 Organoids
注意: 此协议基于以前在本实验室中发布的研究8。
- 准备 3D organoid 的介质, 由50% 个 Wnt 条件和20% 个 spondin 条件的介质组成。
- 制备 wnt 条件培养基, 培养 wnt 生长培养基中的 L 细胞 (Dulbecco 修饰的鹰培养基 (DMEM), 10% 胎牛血清 (血清), 1% 青霉素/链霉素) 7 天, 收获培养基, 并使用0.22 µm 过滤器进行过滤。
- 准备 R-spondin 条件介质。在 r-spondin 生长培养基 (Dulbecco 修饰的鹰培养基 (DMEM), 10% 胎牛血清 (血清), 1% 青霉素/链霉素) 中生长一种改良的 HEK-293T r-spondin 分泌细胞系。2小时后附着, 将培养基从这些细胞转变为 OPTIMEM 生长培养基, 1% 青霉素/链霉素。将细胞培养7天。然后用0.22 µm 过滤器收割 spondin 条件介质和过滤器。
注意: 此协议以前已发布, 对于更详细的协议, 请参阅6、7、8。
- 解冻生长因子减少, 苯酚无红基底膜基质为16小时的冰在4摄氏度。在一个大型塑料容器中收集在冷 Ca2 +/毫克2 +中的 DBPS 的组织。储存在冰上直到开始步骤1.4。
注: 组织是收集的病人进行袖状切除术。 - 使用镊子, 在含有100毫升 Ca2 +/毫克2 +-游离 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 的无菌烧杯中大力冲洗组织。洗涤大约三十年代或直到残骸和血液被去除了。接下来, 使用无菌纱布, 从上皮中抹去粘液层。
- 使用大钳, 牢牢抓住组织的肌肉层, 用力, 用大弯止血钳刮走上皮。将擦伤的上皮碎片收集成无菌的聚苯乙烯培养皿。
- 用剃刀将上皮组织分成大约 2.0 x 2.0 毫米2大小的碎片, 以优化组织消化。用 ca2 +/毫克2 + -免费 DBPS 补充抗生素 (ca2 +/毫克2 + -免费 DPBS) 清洗组织碎片, 1% 青霉素/链霉素, 0.25 毫克/毫升两性霉素 B/10 毫克/毫升庆大霉素, 50 毫克/毫升卡那霉素), 直到洗的时候没有血。如有需要, 进行多次清洗。把洗涤用不育的纱布仔细过滤成一个废烧杯。
- 收集洗涤片段成一个125毫升玻璃圆底烧瓶与25毫米搅拌棒和预热孵化介质 (基底介质补充2毫米 l-谷氨酰胺, 1% 青霉素/链霉素, 10 毫米 HEPES 缓冲, 1 毫克/毫升胶原酶 1, 2 毫克/毫升细胞培养级牛血清白蛋白)。用橡胶隔膜封住圆底烧瓶。
- 将20克的脊椎针插入到隔膜中, 并将其连接到带橡胶冲洗的氧气罐中。要过滤掉任何污染物, 请在油管中插入纸巾以创建过滤器。打开低的氧气流出。插入 10-15 流出针进入隔膜, 以避免隔膜破裂。
- 使用夹子将设置固定到一个环形支架上, 并将其放置在水浴中, 用搅拌板校准到37°c, 30-45 分钟。在组织孵化了15分钟后, 取出50µL 的孵化培养基, 并在视觉上检查游离腺体。如果腺体不致密或未与组织分离, 则额外留出 5-10 分钟。
- 紧接孵化后, 加入50毫升预加热 DMEM/F12, 使用不育的血清吸管或直接倒入孵化混合物中孵化培养基。
- 通过无菌纱布将腺体混合物过滤成四50毫升圆锥管。把滤液放在冰上15分钟, 让提取的腺体沉淀到锥形管的底部。注意不要扰乱已沉淀的腺体, 用血清学吸管去除和丢弃前40毫升的上清。并用重悬10毫升10毫升 DPBS 补充抗生素。
- 将混合物均匀地分布到5毫升细胞培养试管中。离心机为5分钟在 65 x g 在4°c 和去除上清液用吸管仔细。用吸管或200µL 宽吸管尖并用重悬在解冻基底膜基质中的腺体颗粒。混合均匀。
注意: 在冰上执行这一步骤是非常重要的, 在混合时避免基底膜基质的聚合。另外, 通过抽样检查50µL 的腺体密度是很重要的。最佳密度为70% 融合。 - 接下来, 用一个宽尖的吸管在50µL 基底膜基质中的腺体。避免在电镀时产生气泡。
- 为使基底膜基质聚合, 孵育 10-15 分钟37摄氏度。如果镀在一个12井培养板, 添加1毫升的 hFGO 介质 (先进的 Dulbecco 的改良鹰 medium/F12 培养基补充 2mM l-谷氨酰胺, 1% 青霉素/链霉素, 0.25 毫克/毫升两性霉素 B/10 毫克/毫升庆大霉素, 50 毫克/毫升卡那霉素, 10 毫米 HEPES缓冲器, 1 毫米 n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% 个 Wnt 条件培养基, 20% R spondin 条件培养基补充 100 ng/毫升骨形成蛋白抑制剂, 1 nM 胃泌素, 50 ng/毫升表皮生长因子, 200 ng/毫升成纤维细胞生长因子 10, 10毫米烟酰胺, 和10µM Y-27632 岩石抑制剂) 每井。如果不使用12井培养板, 添加足够的介质淹没基底膜基质气泡。
- 在 5% CO2加湿细胞培养孵化器中培养37°c 的细胞。每4-5 天更换一次媒体。
2. 建立鼠源性3D 胃胃底 Organoids
注意: 此协议以前已发布6。在冰上解冻基底膜基质, 并在开始前准备所有试剂。
- 用研究机构批准的方法来牺牲老鼠。从鼠标中取出胃, 并根据以前发布的协议6进行解剖。20毫升冰冷 Ca2 +/毫克2 +-免费 DBPS。
注: C57BL/6 小鼠, 年龄为 8-10 周, 用于胃底胃 organoid 培养。在胃切除前, 通过吸入二氧化碳和人工颈椎脱位, 对小鼠进行安乐死。 - 将肌肉层从胃和任何可见的血管剥离为以前发布的6。
- 用不育的剃刀刀片从窦和前胃癌中分离出眼底。切开眼底使用小手术剪刀到片断大约 2.0 x 2.0 毫米. 使用镊子, 将碎片收集到含有 EDTA 孵化缓冲器的15毫升圆锥管 (Ca2 +/毫克2 +-免费 DPBS, 5mM EDTA), 并在4摄氏度孵化为 2 h 与温柔的鼓动。
- 在无菌罩中, 在冰上留下圆锥管和碎片大约5分钟. 使用吸管去除尽可能多的孵化缓冲, 留下碎片。添加5毫升震动缓冲器 (1 克 D-山梨醇, 1.47 克蔗糖在100毫升 Ca2 +/毫克2 +-免费 DPBS) 和握手与一支力量为2分钟. 允许大的碎片定居和匆忙, 使用1000p 吸管, 删除尚未解决的小碎片在顶层。
- 旋转被去除的片断为5分钟在4°c 在 65 x g。
- 同时避免气泡, 去除上清, 并用重悬在基底膜基质和混合, 直到它是均匀的。
- 使用宽尖端吸管将基底膜基质在50µL 每井, 然后孵育37摄氏度20分钟。
- 添加足够的 mFGO 生长媒体 (先进的 Dulbecco 的改良鹰 medium/F12 培养基辅以 2mM l-谷氨酰胺, 1% 青霉素/链霉素, 10 毫米 HEPES 缓冲器, 1mM n Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt 条件的培养基, 20% R-spondin 条件培养基辅以 100 ng/毫升骨形态发生蛋白抑制剂, 10 nM 胃泌素, 50 ng/毫升表皮生长因子, 10 ng/毫升成纤维细胞生长因子 10, 10 µM Y-27632 岩石抑制剂) 淹没气泡。
- 培养细胞在37°c, 5% CO2加湿细胞培养孵化器。每 4-5 天更改媒体。
3. 2D 转移用胶原蛋白涂层
注意: 除非另有规定, 否则在无菌组织培养罩中执行所有步骤。在将 3D organoids 转移到单层之前, 开始胶原涂层24小时。保持鼠尾胶原蛋白在冰上, 并屏蔽光。胶原蛋白涂层板是良好的长达2周。如果不立即使用涂层板, 包装在 parafilm 和存储在4°c, 直到需要。
- 用20毫米醋酸稀释鼠尾胶原蛋白到50µg/毫升。
- 用稀释后的胶原蛋白充分覆盖井表面。为一井在标准12井板材, 外套与大约1毫升胶原蛋白。在室温下以无菌罩过夜。
- 清洗两次与1毫升 Ca2 +/毫克2 +-免费 DPBS 每井和离开发现2小时在室温下的无菌罩。
4. 2D 转移用基底膜基质涂层
注意: 除非另有规定, 否则在无菌组织培养罩中执行所有步骤。在将 3D organoids 转移到单层之前, 开始基底膜基质涂层2小时。把地下室的膜基质放在冰上。涂层板应立即使用, 不能储存一段较长的时间。
- 在15毫升锥形管中稀释基底膜基质, 细胞培养级水的比例为1:10。在冰上稀释。
- 用吸管将稀释基底膜基质的100µL 添加到标准12井板的每个井中。使用一个细胞刮刀, 均匀地分配稀释基底膜基质在整个井为均匀外套。
- 孵育37°c 为1小时。
- 在转移 3D organoids 前, 用吸管去除残余水分, 室温干燥1小时。
5. 3D 米/hFGOs 到2D 胃上皮细胞膜的转移
- 3D 鼠或人源 FGOs 经过培养 6-7 天后, 开始向2D 单层转移 3D organoids。
注: 对于每一个单层所需的井, 建议使用300完整的 organoids 或从 300 organoids 中提取的单个细胞。在一个健壮的文化, 它有望获得大约 150 organoid/井内12井培养板。 - 在转移前一定要涂上盘子。
注: 基底膜基质涂层板具有半透明的凝胶层, 但胶原涂层板不会有任何明显的涂层迹象。 - 直接吹打1毫升无菌 Ca2 +/毫克2 +-自由 DBPS, 从板上取出3D 基底膜基质气泡到气泡中心。
- 用吸管将基底膜基质和 organoid 混合物收集到细胞培养试管中。收集的比例为2基底膜基质气泡每管。离心机为5分钟在 40 x g 和4°c。
- 使用真空系统, 去除上清和尽可能多的基底膜基质。并用重悬在4毫升的Ca2 +/毫克2 +-免费 DBPS, 删除上清, 并重复 2-3 次。对于整个 organoid 传输协议, 请继续执行步骤5.10。继续执行单单元暂停协议的步骤5.7。
- 预热细胞脱离溶液至37摄氏度, 每试管加1毫升。用吸管轻轻地将管子或吹打混合。孵育10分钟, 在37摄氏度。
- 将2毫升的 Ca2 +/毫克2 +-免费 DBPS 直接添加到每个测试管。
- 使用26克针和注射器的混合物 2-3 倍。目视检查单个单元格。注射器 1-2 倍, 如果仍然有 organoids 或集群的细胞。
- 离心机在 40 x g 5 分钟在4摄氏度。并用重悬 2D FGO 介质中的颗粒(2D 鼠标 FGO 生长介质: 高级 Dulbecco 改性鹰 medium/F12 培养基辅以 2mM l-谷氨酰胺, 10 毫米青霉素/链霉素, 10% 胎小牛血清, 10 毫米 HEPES 缓冲器, 1 x N2, 1 x B27,辅以 10 nM 胃泌素, 50 的表皮生长因子, 1 µM TGF β抑制剂, 10 µM Y-27632 岩石抑制剂。2D 人类 FGO 生长培养基:先进的 Dulbecco 改性鹰 medium/F12 培养基辅以 2mM l-谷氨酰胺, 1% 青霉素/链霉素, 10 毫米 HEPES 缓冲器, 10% 胎小牛血清, 10 毫米烟酰胺, 1 x N2, 1 x B27, 补充50毫克/毫升卡那霉素, 50 ng/毫升表皮生长因子, 和10µM Y-27632 岩石抑制剂, 1 µM TGF β抑制剂)。
- 将泥沙在涂覆板上。孵育板在37°c。如果介质变黄, 则每隔4天或更早更换介质。单层需要大约4天的时间来形成。
6. 用2D 胃上皮细胞单分子膜进行刮伤试验
- 使用剃刀刀片, 当文化达到100% 融合时, 划伤单层。
- 室温下用3.7% 甲醛固定膜, 15 分钟。Permeabilize 0.5% 非离子洗涤剂/PBS, 室温20分钟。
- 下块单膜与2% 驴血清1小时室温和孵化1:1000 稀释 h+, K+-atp 酶原抗体隔夜在4°c, 洗涤与0.1% 非离子洗涤剂/PBS 和孵化与1:100 稀释驴抗鼠488次抗体和 10μg/毫升赫斯特细胞核染色1小时室温。
- 为确定2D 人源胃单层培养物中的表面黏液细胞, 用20微克/毫升荆豆刺猬 (UEAI) FITC 共轭染色细胞。共聚焦显微镜上的图像单膜。
- 每隔几小时就拍下伤口的图像, 根据单层的质量和患者之间的变化, epithelialize 将会重 24-48 小时。
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Representative Results
Organoids 是从人的主体/身体或鼠胃组织的眼底 (图 1A) 派生的。在胶原酶或 EDTA 消化的人或老鼠的胃组织分别后, 腺体埋入基底膜基质和培养 6-7 天 (图 1A)。图 1B演示了人源性胃 organoids (huFGOs) 的形成, 然后将其转移到基底膜基质涂层室幻灯片上的胃上皮层 (huGEM) 上。经过4天的文化, 汇合 huGEMs 被用于刮伤化验 (图 1B)。从 huGEM 的时间推移分析中收集的图像显示, 在24小时内, 文化中的伤口闭合 (图 2)。
HuGEMs 被发现表达了在本机胃组织中发现的主要细胞血统。免疫荧光染色显示了由顶叶 (图 3B, C) 和表面粘液 (图 3B, D) 细胞组成的极化 e-钙黏素阳性单层的表达。PCR 分析使用从这些单分子收集的 RNA 证实了顶叶和表面粘液细胞的表达, 除了主要和粘液颈部细胞 (图 3E)。汇合 huGEMs 也表达了少量增殖细胞 (图 3F)。对这些主要细胞血统的分析在划伤试验中发现, 在24小时的时间段内, 顶叶、大副、粘液颈部表面粘液细胞的持续表达 (图 4A, B)。这些数据表明, 利用 huGEMs 作为新的培养系统来研究胃再生的体外。
图 1: 生成人源性胃 organoids (huFGO) 和原发性胃上皮膜 (huGEM)。(A)用于为 organoid 文化生成腺体的人体胃组织和小鼠胃的代表图像。轮廓区域表示鼠标胃的胃底区域。(B)产生人源性胃 organoids (huFGOs), 用于培养人源性胃上皮膜 (huGEMs)。huGEM 的代表性形象, 划伤后显示受伤地区。缩放条 = 500 微米请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 刮伤检测.使用 huGEM 0、8、16和 24 h 在划伤后的时间推移实验收集的代表性图像。缩放条 = 500 微米请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: huGEM 文化中主要细胞血统的表达式.huGEM 培养的免疫荧光染色演示(A) E 钙粘蛋白的表达式 (Ecad, 红色), 表面粘液细胞 (UEAI, 绿色) 和核 (赫斯特, 蓝色) 和(B) E 钙粘蛋白 (Ecad, 红色), 顶叶细胞 (香港, 绿色) 和核 (赫斯特, 蓝色)。单独的通道显示在(C)和(D)中。(E) rt-pcr 是使用从 huGEMs 提取的 RNA 进行的, 用于表达 H+K+atp 酶 (ATP4a)、胃蛋白酶 C (PgC)、MUC5AC 和 MUC6。(F)在 huGEM 文化内的增殖细胞, 由教育局 (红色) 吸收决定。刻度条 (A D) = 50 微米, 刻度条 (F) = 100 微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 刮伤试验中细胞谱系表达式的变化.使用从 huGEM 文化0、8、16和24小时后收集的幻灯片显示 E 钙黏蛋白 (Ecad、红色) 或表面粘液细胞 (UEAI、绿色) 或顶叶 (赫斯特、蓝色) 的 huGEM 文化的免疫荧光染色刮伤。Bkgrd = 在幻灯片上基底膜基质的背景染色。XY 轴刻度条从 0-400 微米。请单击此处查看此图的较大版本.
| 鼠标3D 介质 | 库存解决方案 | 工作浓度 |
| nAcetylcysteine | 粉 | 1毫米 |
| 胃 泌 素 | 10µM | 10毫微米 |
| Egf | 500µg/毫升 | 50 ng/毫升 |
| 脑袋 | 100µg/毫升 | 100 ng/毫升 |
| FGF10 | 100µg/毫升 | 100 ng/毫升 |
| YCMD | 10毫米 | 10µM |
| B27 | 50x | 1x |
| N2 | 100x | 1x |
| 笔/链球菌 | 1米 | 10毫米 |
| HEPES | 1米 | 10毫米 |
| Glutamax | 200毫米 | 2毫米 |
| Wnt | 50% 伏/五 | |
| R-Spondin | 10% 伏/五 |
表 1: 鼠标3D 介质组件。
| 鼠标2D 介质 | 库存解决方案 | 工作浓度 |
| Fcs | 100% | 10% |
| YCMPD | 10毫米 | 10µM |
| 胃 泌 素 | 10µM | 10毫微米 |
| Egf | 500µg/毫升 | 50 ng/毫升 |
| B27 | 50x | 1x |
| N2 | 100x | 1x |
| 笔/链球菌 | 1米 | 10毫米 |
| HEPES | 1米 | 10毫米 |
| Glutamax | 200毫米 | 2毫米 |
| TGF-β抑制剂 | 10毫米 | 1µM |
表 2: 鼠标2D 介质组件。
| 人类3D 媒体 | 库存解决方案 | 工作浓度 |
| 烟 酰 胺 | 粉 | 10毫米 |
| nAcetylcysteine | 粉 | 1毫米 |
| 胃 泌 素 | 10µM | 1毫微米 |
| Egf | 500µg/毫升 | 50 ng/毫升 |
| 脑袋 | 100µg/毫升 | 100 ng/毫升 |
| FGF10 | 100µg/毫升 | 200 ng/毫升 |
| YCMD | 10毫米 | 10µM |
| B27 | 50x | 1x |
| N2 | 100x | 1x |
| 笔/链球菌 | 1米 | 10毫米 |
| HEPES | 1米 | 10毫米 |
| Glutamax | 200毫米 | 2毫米 |
| 卡那霉素 | 1米 | 10毫米 |
| 两性霉素 B/庆大霉素 | 125µg/毫升 | 1毫米 |
| Wnt | 50% 伏/五 | |
| R-Spondin | 10% 伏/五 |
表 3: 人体3D 介质组件。
| 人类2D 媒体 | 库存解决方案 | 工作浓度 |
| Fcs | 100% | 10% |
| YCMPD | 10毫米 | 10µM |
| 胃 泌 素 | 10µM | 1毫微米 |
| Egf | 500µg/毫升 | 50 ng/毫升 |
| B27 | 50x | 1x |
| N2 | 100x | 1x |
| 笔/链球菌 | 1米 | 10毫米 |
| HEPES | 1米 | 10毫米 |
| Glutamax | 200毫米 | 2毫米 |
| TGF-β抑制剂 | 10毫米 | 1µM |
| 烟 酰 胺 | 粉 | 10毫米 |
| 卡那霉素 | 1米 | 10毫米 |
表 4: 人体2D 介质组件。
| 实验问题 | 疑难解答提示 |
| 单分子膜无法从 organoids 形成 | 1) 本议定书的最佳培养条件因实验需要而异。使用玻璃或塑料培养皿时, 应使用稀释基底膜基质培养 organoids 的人和小鼠单分子细胞。然而, 鼠尾胶原是最佳的单层实验的小鼠或人的起源, 需要聚酯膜插入。2) 最佳培养条件因实验设置而异。采用单细胞悬浮培养的培养方法理想是采用 3D FGO 培养基, 而完整的 organoids 则采用 2D FGO 培养基培养。 |
| 从老年患者 (> 55 岁) 或小鼠 (> 18 月) 获得的单分子膜未能生长并达到融合 | 如果使用从老龄小鼠 (> 18 月) 或患者 (> 55 年) 收集的胃组织, 则应加倍用于生成单层的 organoids 密度, 以减少 organoids 的生长效率。 |
| Organoids 无法从腺体形成 | 建议使用新鲜的 (如果可能的话, 新购买的) 胃泌素。 每4月使用新鲜的胃泌素。 |
| Organoids 无法附着和形成单分子膜 | 确保在收获 organoids 后, 有效去除基底膜基质, 使其转移到培养皿中。 |
| 来自老年患者 (> 55 岁) 或小鼠 (> 18 月) 的文化失败 | 在消化和潜伏期, 15-30 分钟的初始孵化后, 5 分钟的孵化间隔, 必要的是足够的。应该指出的是, 55 岁以上的患者可能有腺体更容易分离, 因此需要减少消化。同样, 来自老年患者的 FGOs 显示生长时间较慢, 对离心反应的敏感性增加。为了获得最佳效果, 在使用老化组织时限制任何多余的离心, 及时更换介质。 |
表 5: 疑难解答提示.遇到的问题和建议的决议, 以优化建立和培养人或小鼠胃膜。
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Discussion
本议定书详细说明了建立人和老鼠的胃上皮膜, 可用于刮伤检测。该协议依赖于从原始人 (或小鼠) 组织中分离出的干细胞的概念, 是由 Schlaermann et al7首次发布的修改后的协议。特别是, 我们已经优化的协议, 以建立一个汇合和极化胃上皮单层, 表达的主要细胞血统, 可以发现在胃上皮内在体内。胃溃疡修复是一个复杂的过程, 涉及组织重新上皮, 再生和扩散9,10,11。特别是, 我们的实验室报告说, 胃上皮的再生与 spasmolytic 多肽/三叶因子 (TFF) 2-表达化生 (SPEM) 的出现在溃疡边缘的再生胃腺之间的吻合12,13。SPEM 被定义为主要细胞谱系的转分化成粘液细胞化生的14 , 在粘膜恢复到正常的细胞组成12时出现损伤并消失。因此, 在体外系统中研究这样一种机制, 重要的是, 主要细胞谱系, 例如主要细胞, 都存在于文化中。
使用刮伤化验已广泛用于研究修复和再生, 直到最近, 胃癌细胞系使用1,2,3,4。虽然利用胃癌细胞系揭示了基本机制, 但这些培养的改变和缺乏本机胃组织的细胞多样性。HuGEMs 被证明保留一个极化和多样的细胞组成, 密切概括胃上皮在体内。另外, 在到达融合 huGEM 文化在最佳的情况下可以被维护至多一个月。扩展的文化允许长期的实验。因此, 可以考虑的 huGEMs 的未来应用包括单层/免疫细胞共培养和长期实验研究的幽门螺杆菌发病机制。
在当前的协议中有重要的技术方面需要注意。第一个技术要点是, 基底膜组件的选择取决于要用于实验的细胞培养表面。为了确保达到最佳的单层条件, 建议使用胶原蛋白, 当使用膜的实验需要用聚酯薄膜插入板。然而, 如果单层实验需要玻璃或塑料培养表面, 稀释基底膜基质是最佳的选择涂层。其次, 要达到汇合单层所需的 organoids 密度必须根据病人的年龄来调整, 这取决于收集胃组织的时间。对于从老龄小鼠 (> 18 月) 或患者 (> 55 岁) 收集的组织, 由于老年个体的生长能力下降, 在转移到单层时使用的 organoid 密度应增加两个。在消化和孵化的人组织从老年患者, 腺体可能更容易离解和离心, 因此: 1) 应尽可能少的离心, 2) 介质更换努力, 和 3) 在消化孵化15到30分钟的增量消解5分钟之后将减少过度消化的可能性。最后, 在 organoid 细胞悬浮液中形成单分子膜时, 3D FGO 培养基最适合于膜的适当形成, 而当从完整的 organoids 培养时, 2D FGO 培养基的效率最高。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到 NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 补助金 (YZ) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
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