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Biologia

Protocolo experimental para o uso de drosófila como um sistema modelo invertebrados para testes de toxicidade em laboratório

Published: July 10, 2018
doi:
10.3791/57450
,
1Communities for Building Active STEM Engagement,Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology,Colorado State University-Pueblo

Summary

Neste trabalho, nós fornecemos um protocolo detalhado para expor a espécie do género Drosophila aos poluentes com o objetivo de estudar o impacto da exposição sobre uma gama de saídas fenotípicas em diferentes estádios de desenvolvimento e para mais de uma geração.

Abstract

Propriedades emergentes e fatores externos (população-ecossistema-nível e interações, em particular) desempenham um papel importante na mediação ecologicamente importantes pontos de extremidade, embora raramente são considerados em estudos toxicológicos. D. melanogaster está emergindo como um modelo de toxicologia para os impactos comportamentais, neurológicos e genéticos das substâncias tóxicas, para citar alguns. Mais importante, a espécie do género Drosophila pode ser utilizado como um sistema modelo para uma abordagem integrativa quadro para incorporar propriedades emergentes e responder perguntas ecologicamente relevantes na pesquisa de toxicologia. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para expor espécies do género Drosophila aos poluentes para ser usado como um sistema modelo para uma gama de saídas fenotípicas e perguntas ecologicamente relevantes. Mais especificamente, este protocolo pode ser usado para 1) link vários níveis biológicos de organização e compreender o impacto de substâncias tóxicas em ambos adequação do nível de indivíduo e população; 2) testar o impacto de substâncias tóxicas em diferentes estágios de desenvolvimento, exposição; 3) implicações de várias gerações e evolutiva teste de poluentes; e 4) testar vários contaminantes e estressores simultaneamente.

Introduction

Todos os anos, aproximadamente 1.000 novas substâncias químicas são introduzidas pela indústria química1,2; no entanto, os impactos ambientais de apenas uma pequena percentagem destes produtos químicos são testados antes de distribuição2,3. Apesar de catástrofes em grande escala são incomuns, exposição crônica e subletais de uma grande variedade de poluentes são difundidos em seres humanos e animais selvagens4,5. O foco histórico de Ecotoxicologia e toxicologia ambiental foi testar a letalidade, única exposição química, exposição aguda e os efeitos fisiológicos da exposição, como um meio de medir o impacto de poluentes na sobrevivência6, 7 , 8 , 9 , 10. embora não haja uma mudança no sentido éticas e não-invasiva de abordagens à experimentação animal, as abordagens atuais estão limitando por causa do papel esse desenvolvimento, propriedades emergentes e fatores externos (tais como o nível de população e interações do ecossistema-nível) jogam na mediação ecologicamente importantes pontos de extremidade8. Portanto, há uma necessidade de métodos que incorporem uma abordagem mais holística, sem sacrificar a vida selvagem e/ou vertebrados no laboratório.

Sistemas modelo de invertebrados, como Drosophila melanogaster, são uma alternativa atraente para abordar a necessidade de uma abordagem mais holística para testes de toxicidade. D. melanogaster, foi originalmente desenvolvido como um sistema modelo invertebrados para pesquisas genéticas relacionadas a humanos há um século atrás11. D. melanogaster agora é proeminentemente usada como uma alternativa de modelo de vertebrados por vários motivos: 1) a conservação de genes e vias entre d. melanogaster e humanos; 2) tempo de geração curto em relação aos modelos de vertebrados; 3) barato custo de manutenção; 4) facilidade na geração de tamanhos de amostra grande; e 5) pletora de fenotípica e ecologicamente-relevantes pontos de extremidade disponíveis para testes11,12,13,14,15,16,17 .

Vários laboratórios11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 estão usando d. melanogaster como uma alternativa de vertebrados modelo para testes de toxicidade para compreender os impactos da poluição sobre os seres humanos. Espécies selvagens locais de Drosophila podem ser utilizadas, também, como modelos de toxicidade para a vida selvagem (e humanos) responder ecologicamente-, comportamentalmente-e evolutivamente relevantes perguntas em vários níveis biológicos de organização. Utilizando espécies do género Drosophila como modelo, vários pontos de extremidade mensuráveis são possíveis11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. In addition, usando o modelo de Drosophila , toxicologistas podem: 1) eticamente vincular os efeitos em vários níveis biológicos da organização; 2) incorporar o papel de fatores emergentes e desenvolvimento; 3) estudo ecologicamente importantes pontos de extremidade (além de medicamente importantes pontos de extremidade); 4) testar vários estressores simultaneamente; 5) e teste a longo prazo várias gerações (por exemplo, evolutiva e transgeracional) implicações de estressores. Portanto, usar drosófila como um sistema de modelo permite que uma multiplicidade de abordagens, que não se limitando a estudar abordagens mecanicistas com linhagens puras de d. melanogaster no laboratório.

Neste trabalho, apresentamos os métodos para criação e coletando drosófila para responder a várias questões toxicológicas. Mais especificamente, descrevemos a metodologia para 1) criação de Drosophila em meio misturado com um ou mais poluentes; 2) coletando Drosophila durante todo o desenvolvimento (por exemplo, vagando larvas de terceiro instar, casos pupal, recém-eclosed adultos e adultos); e 3) criação de Drosophila a médio contaminado teste intergeracional e transmissão transgeracional, bem como as implicações evolutivas de exposição tóxica a longo prazo. Usando este protocolo, anterior autores18,19,20,21,22,23,24,25 relataram diferentes efeitos fisiológicos, genéticos e comportamentais do desenvolvimento chumbo (Pb2 +) exposição. Este protocolo permite toxicologistas usar uma abordagem mais holística e toxicológica, que é essencial para a compreensão de como os poluentes são fatores de risco para os seres humanos e animais selvagens em um ambiente cada vez mais poluído.

Protocol

O seguinte é um protocolo experimental usado para trás espécies do gênero Drosophila no meio contaminado quando a ingestão oral de uma toxina é apropriada; outras formas de exposição são possíveis usando a drosófila modelo11,15,16,26. Os métodos descritos neste protocolo têm sido descritos anteriormente por Hirsch et al . 19 e Pete…

Representative Results

Ao expor oralmente drosófila para uma contaminant(s) durante todo o desenvolvimento, várias questões toxicológicas podem ser testados, expondo a drosófila em diferentes níveis de organização biológica. Esta seção apresenta resultados representativos obtidos usando este protocolo em artigos publicados anteriormente23,24. Em particular, este protocolo foi usado anteriormente para avaliar a acumulação, …

Discussion

Drosophila melanogaster foi estabelecido como um poderoso modelo para uma variedade de processos biológicos devido a extensa conservação de genes e vias entre d. melanogaster e humanos13,14. Pelas mesmas razões que é um poderoso modelo para a ciência médica, Drosophila tem emergido como um sistema de modelo adequado para estudar o impacto da poluição antropogênica sobre uma série de parâmetros toxicológicos. Vários laborat…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta publicação foi apoiada por uma concessão do Ministério da educação (PR prêmio #P031C160025-17, o título do projecto: 84,031 C) para as comunidades de Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) para construir tronco ativo engajamento (C-BASE). Agradecemos a atual zoologia e Elsevier para fornecer os direitos para usar os resultados representativos publicado em papéis anteriores, bem como os editores de JoVE por nos oferecer a oportunidade de publicar este protocolo. Gostaríamos também de agradecer o programa C-BASE, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE e departamento de biologia, CSU-Pueblo), departamento de biologia da CSU-Pueblo, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (departamento de biologia, Skidmore College) e Dr. Claire Varian Ramos (Departamento de biologia, Universidade do estado do Colorado-Pueblo) pelo apoio e assistência.

Materials

Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24 Carolina Biological 173204
Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit Genessee Scientific 32-116SB Used to store flies
Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials Genessee Scientific 49-102 Used to store flies
Cardboard trays, trays only, narrow Genessee Scientific 32-124 Used to organize populations of flies
Cardboard trays, dividers only, narrow Genessee Scientific 32-126 Used to organize populations of flies
Thermo Scientific Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure Fischer Scientific 03-312D Useful for storage of contaminants
Thermo Scientific Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles Fischer Scientific 03-409-17C Useful for storage of contaminants
Eppendorf Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser Fischer Scientific 14-287-150 Used to prepare medium
Combitips Advanced Pipetter Tips – Standard, Eppendorf Quality Tips Fischer Scientific 13-683-708 Used to prepare medium
Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm) Genessee Scientific 59-114 Used to anesthetize flies
Flystuff foot valve Genessee Scientific 59-121 Used to anesthetize flies
Tubing, green (1 continguous foot/unit) Genessee Scientific 59-124G Used to anesthetize flies
Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle VWR 97064-130 Used to make a morgue
Glass Erlenmeyer Flask Set – 3 Sizes – 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2 Walmart Not applicable Used to make a morgue
BGSET5 Glass Beaker Set Of 5 Walmart
Inbred or wildtype line of Drosophila Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University https://bdsc.indiana.edu
Wild popultions of Drosophila UC San Diego Drosophila Stock Center https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php
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DrosophilaToxicity TestingInvertebrate ModelDose ResponseGrowth MediumDevelopmental StagesLarvaeAdultsExposureContaminants
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Citar este artigo
Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory. J. Vis. Exp. (137), e57450, doi:10.3791/57450 (2018).
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