Обнаружение Инфламмасома активации и Pyroptotic клеточной гибели в мышиных макрофагов, костного мозга, полученных
Summary
Мы описываем обнаружения NLRP3 Инфламмасома активации на основе сотовой с помощью флуоресцентной микроскопии и пятнать для активно caspase-1 и адаптер, ASC. Лактатдегидрогеназа выпуска пробирного представлен для обнаружения pyroptotic лизиса на основе населения. Эти методы могут быть адаптированы для изучения многих аспектов биологии Инфламмасома.
Abstract
Inflammasomes являются врожденные иммунные сигнализации платформ, которые необходимы для успешного управления многих патогенных организмов, но и способствуют воспалительных и autoinflammatory заболеваний. Inflammasomes активируются цитозольной шаблон признание рецепторов, включая членов семьи NOD-подобные рецепторы (РНБ). Эти рецепторы oligomerize при обнаружении микробиологических или связанного с ней ущерба раздражителей. Последующего набора адаптер белка ASC образует микроскопически видимой Инфламмасома комплекс, который активирует caspase-1 через близость индуцированной auto активации. После активации caspase-1 расщепляет pro-IL-1β и про Ил-18, приводит к активации и секреции этих провоспалительных цитокинов. Caspase-1 также является посредником при воспалительных форма смерти клетки, называют pyroptosis, который включает потери целостности и клеток лизис мембраны. Caspase-1 расщепляет gasdermin D, выпустив N-концевого фрагмента, который формирует поры мембраны плазмы, ведущих к осмотической лизис.
В пробирке, активацию caspase-1 может определяться путем маркировки костного мозга, полученных макрофагов с активности каспазы-1 зонд FAM-YVAD-финских и маркировки клетки с антитела против белков адаптер ASC. Этот метод позволяет определить Инфламмасома формирования и активацию caspase-1 в отдельных клетках, с помощью микроскопии флуоресцирования. Смерть Pyroptotic клетки могут быть обнаружены путем измерения выпуска цитозольной лактатдегидрогеназа в среду. Эта процедура является простой, экономически эффективным и выполненных в формате 96-луночных пластины, позволяя адаптации для скрининга. В этой рукописи мы показываем, что активация NLRP3 Инфламмасома по nigericin приводит к совместно локализации адаптер белка ASC и активно caspase-1, приводит к pyroptosis.
Introduction
Инфламмасома опосредованной воспаление является важнейшим компонентом обороны против патогенных организмов1, но также лежит в основе этиологию многих заболеваний2. Воспалительной реакции на широкий спектр инфекций вызванных цитозольной обнаружение патоген-связанные молекулярные структуры (PAMPs) или повреждения связанные молекулярные структуры (DAMPs). Шаблон признание рецепторов (ПРР), включая членов семьи NOD-подобные рецепторы (РНБ), oligomerize при обнаружении Эти PAMPs и DAMPs. Это вызывает формирование комплекса различных белков называется Инфламмасома, который содержит ПРР, адаптер белка апоптоз связанные спек как белок, содержащий домен caspase набор C-терминала (карта) (ASC) и про форма ,caspase-134. Этот комплекс позволяет близость индуцированной auto активацию caspase-1. Активно caspase-1 затем приводит к набор событий, которые характерны pyroptosis путь смерти воспалительных клеток. Эти мероприятия включают: расщепление и релиз цитокинов ИЛ 1β и IL-18, лизосома экзоцитоз с высвобождение лизосомальных содержимого в внеклеточного пространства, ядерной конденсации и gasdermin D расщепления. Выпущенные N-концевой домен gasdermin D вставляет в плазматической мембране, образуя поры, которые вызывают разрыв мембраны плазмы и выпуску воспалительных содержимого, в дополнение к унося защитный нишу для патогена репликации5, 6 , 7.
Здесь мы сосредоточены на хорошо изученных Инфламмасома NLRP3. Активация NLRP3 Инфламмасома происходит через двухэтапный процесс8. Первый шаг «грунтовки» происходит через признание Толл подобные рецепторы (TLR) микробной продукта. Это реплицируется в лабораторных условиях с помощью ПЛАСТИНОК для стимулирования TLR4. Эта стимуляция upregulates NLRP3 и про IL-1β через NF-kB сигнализации. Грунтовка дополнительно лицензии NLRP3 через не-транскрипционный анализ механизмов, вызывая его deubiquitination9,10 и фосфорилирование или дефосфорилирование конкретные остатки11,12.
Второй сигнал для активации NLRP3 подумал привлечь митохондриальной факторов, реактивнооксигенных видов, измеряем калия и кальция сигнализации, хотя объединяющей механизм для активации NLRP3 остается недостижимой8. Активированные NLRP3 oligomerizes через взаимодействие между его NACHT доменов и новобранцев ASC через привязку доменов Пырин (PYD)13. В каждой ячейке эти макромолекулярных комплексов образуют единый микроскопически видимые фокус. ASC была первоначально определена как 22 кДа белков, который образуется «пятнышко» во время апоптоз клеток лейкемии человека, так и именованные апоптоз связанные спек как белок, содержащий карты14. Позже было установлено, что ASC новобранцев pro-caspase-1 через взаимодействие карты ASC с картой pro-caspase-1, образуя Инфламмасома15.
Не все NLRs требуют присутствия ASC побудить активацию caspase-1. В отличие от NLRP3 NLRC4 и NLRP1b имеют карты доменов и может непосредственно набирать pro-caspase-1 через карты-карты взаимодействия, чтобы побудить активацию caspase-1. В отсутствие ASC активно caspase-1 остается диффузных в цитозоле и не образуют единый фокус. Этот диффузных активно caspase-1 достаточно вызвать смерть клетки pyroptotic, но не может обработать pro ИЛ 1β13,16.
В этой рукописи мы будем обсуждать два способа оценить Инфламмасома активации. Первый использует действие флуоресцентный зонд, FAM-YVAD-финляндских марок, который связывает caspase-1 семьи протеаз. Это семейство включает caspase-1, но также мыши caspase-11 и человека caspase-4 и caspase-5. Используя все эксперименты макрофагов с несовершенным мыши caspase-1/11, будет рассматриваться специфика этот зонд. Этот метод может сочетаться с антителом маркировки Инфламмасома компонентов, которые мы также будем описывать. Микроскопические визуализации позволяет для идентификации отдельных ячеек, содержащих активные caspase-1 и oligomerized ASC. С помощью этого метода, исследователи смогут определить, где в каскад Инфламмасома формирования их манипуляций клетки-хозяина или патогенного организма изучается эффект. Например можно отличить ли данного вмешательства предотвращает вербовки ASC в сложных NLRP3 или последующего набора и активацию caspase-117. Изучение результатов активацию caspase-1 например, ИЛ 1β секрецию не сможет отличить эти две возможности. Кроме того секрецию ИЛ 1β могут быть изменены без изменения клеток способность активировать caspase-1 и пройти pyroptotic клеток смерть16.
Второй метод измеряет выпуск Лактатдегидрогеназа (LDH) в ячейку супернатанта, которая происходит во время pyroptotic макрофагов лизис после активацию caspase-1, как описано выше. Этот второй метод является подход, основанный на население, как хорошо измеряется выпуска ЛДГ в весь. Этот простой подход для быстрого анализа образцов (30 мин время инкубации) позволяет определить, является ли смерть caspase-1-опосредованной клетки и могут быть выполнены в формате 96-луночных пластины.
Эти методы являются взаимодополняющими, каждый с различными преимуществами и оба легко поддаются модификации. Например макрофагов обработка соединениями целевых небольшой молекулярной массой до стимуляции Инфламмасома может использоваться для расследования роли некоторые белки могут иметь на контроле воспалительных реакций.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы представили два методы для изучения Инфламмасома активации и следствием активацию caspase-1, после NLRP3 стимуляции в мышиных костного мозга-производные макрофагов. Первый метод позволяет исследователю для определения уровня активацию caspase-1 на основе сотовой, с использов?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Все микроскопии было сделано на W. м. кека микроскопии центр при поддержке Натаниэль Питерс и при поддержке NIH премии S10OD016240. S.L.F. поддерживается низ K08AI119142 и R21AI130281. Мы благодарим д-р Ричард Флавелл и д-р Брэд Куксон для несовершенным мыши caspase-1/11 и д-р Брэд Куксон для совместного использования лабораторных помещений и оборудования.
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
Referências
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
