Murine अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में Inflammasome सक्रियण और Pyroptotic कोशिका मृत्यु का पता लगाने
Summary
हम सेलुलर आधार पर NLRP3 inflammasome सक्रियण का पता लगाने का वर्णन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और सक्रिय caspase के लिए दाग-1 और अनुकूलक, ए एस सी का उपयोग कर । एक स्तनपान डिहाइड्रोजनेज जारी परख एक जनसंख्या के आधार पर pyroptotic lysis का पता लगाने के लिए प्रस्तुत किया है । इन तकनीकों को inflammasome जीव विज्ञान के कई पहलुओं का अध्ययन अनुकूलित किया जा सकता है ।
Abstract
Inflammasomes जन्मजात प्रतिरक्षा संकेत प्लेटफार्मों कि कई रोगजनक जीवों के सफल नियंत्रण के लिए आवश्यक हैं, लेकिन यह भी भड़काऊ और भड़काऊ रोगों को बढ़ावा देने के हैं । Inflammasomes cytosolic पैटर्न मांयता रिसेप्टर्स, मंजूरी की तरह रिसेप्टर (NLR) परिवार के सदस्यों सहित द्वारा सक्रिय कर रहे हैं । इन रिसेप्टर्स माइक्रोबियल या क्षति से संबंधित उत्तेजनाओं का पता लगाने पर oligomerize । अनुकूलक प्रोटीन ए एस सी के बाद भर्ती एक microscopically दृश्यमान inflammasome परिसर, जो निकटता प्रेरित ऑटो-सक्रियण के माध्यम से caspase-1 सक्रिय रूपों । सक्रियण के बाद, caspase-1 सट प्रो-il-1β और प्रो-il-18, सक्रियण और इन समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के स्राव के लिए अग्रणी । Caspase-1 भी कोशिका मृत्यु के भड़काऊ रूप pyroptosis, जो झिल्ली अखंडता और कोशिका lysis की हानि सुविधाओं मध्यस्थता । Caspase-1 gasdermin डी, N-टर्मिनल टुकड़ा जो प्लाज्मा झिल्ली pores रूपों जारी, आसमाटिक lysis करने के लिए अग्रणी ।
इन विट्रो में, caspase-1 के सक्रियकरण caspase-1 गतिविधि जांच FAM-YVAD-FMK के साथ अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज लेबलिंग द्वारा निर्धारित किया जा सकता है और अनुकूलक प्रोटीन ए एस सी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं लेबल द्वारा । इस तकनीक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर व्यक्तिगत कोशिकाओं में inflammasome गठन और caspase-1 सक्रियण की पहचान की अनुमति देता है । Pyroptotic कोशिका मृत्यु मध्यम में cytosolic स्तनपान डिहाइड्रोजनेज की रिहाई को मापने के द्वारा पता लगाया जा सकता है । इस प्रक्रिया को सरल, लागत प्रभावी है और एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में प्रदर्शन किया, स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलन की अनुमति । इस पांडुलिपि में, हम बताते है कि NLRP3 inflammasome के सक्रियकरण nigericin द्वारा अनुकूलक प्रोटीन ए एस सी और सक्रिय caspase-1 के सह स्थानीयकरण के लिए सुराग, pyroptosis करने के लिए अग्रणी ।
Introduction
Inflammasome-मध्यस्थता सूजन रोगजनक जीवों के खिलाफ रक्षा का एक महत्वपूर्ण घटक है1, लेकिन यह भी कई रोगों के एटियलजि2पर निर्भर करता है । संक्रमण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए भड़काऊ प्रतिक्रिया रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) या नुकसान आणविक पैटर्न (स्पंज) के cytosolic का पता लगाने के द्वारा शुरू हो रहा है । पैटर्न मांयता रिसेप्टर्स (पीआरआर), मंजूरी की तरह रिसेप्टर (NLR) परिवार के सदस्यों सहित, इन PAMPs और स्पंज का पता लगाने पर oligomerize. यह एक बहु प्रोटीन परिसर के गठन के inflammasome, जो पीआरआर, अनुकूलक प्रोटीन Apoptosis-जुड़े धब्बा एक सी-टर्मिनल caspase-भर्ती डोमेन (कार्ड) (ए एस सी) युक्त प्रोटीन की तरह शामिल है, और समर्थक के रूप में caspase-13,4. इस जटिल caspase-1 के निकटता प्रेरित ऑटो-सक्रियण की अनुमति देता है । सक्रिय caspase-1 तो घटना है कि भड़काऊ कोशिका मौत मार्ग pyroptosis की विशेषता है का एक सेट की ओर जाता है । इन घटनाओं में शामिल हैं: दरार और रिहाई के भड़काऊ साइटोकिंस il-1β और il-18, lysosomal अंतरिक्ष में extracellular सामग्री की रिहाई के साथ lysosome exocytosis, परमाणु संघनित्र, और gasdermin डी दरार । प्लाज्मा झिल्ली में gasdermin डी आवेषण के जारी एन टर्मिनल डोमेन, गठन pores कि प्लाज्मा झिल्ली टूटना और भड़काऊ सामग्री की रिहाई के कारण, दूर लेने के लिए एक सुरक्षात्मक जगह के अलावा रोगजनक प्रतिकृति5, ६ , 7.
यहां, हम अच्छी तरह से अध्ययन NLRP3 inflammasome पर ध्यान केंद्रित । NLRP3 inflammasome का सक्रियण एक दो-चरणीय प्रक्रिया8के माध्यम से होता है । पहले “भड़काना” कदम एक माइक्रोबियल उत्पाद के टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLR) द्वारा मांयता के माध्यम से होता है । यह TLR4 को उत्तेजित करने के लिए एलपीएस का उपयोग करके प्रयोगशाला सेटिंग में प्रतिकृति है । यह उत्तेजना NLRP3 और प्रो-IL-1β NF-kB संकेतन के माध्यम से नियंत्रित करता है । इसके अलावा गैर transcriptional तंत्र के माध्यम से NLRP3 लाइसेंस भड़काने के द्वारा अपने deubiquitination9,10 और फास्फारिलीकरण या विशिष्ट अवशेषों के dephosphorylation11,12।
NLRP3 सक्रियण के लिए दूसरा संकेत mitochondrial कारकों, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, पोटेशियम समाप्ति और कैल्शियम संकेतन शामिल करने के लिए सोचा है, हालांकि NLRP3 सक्रियण के लिए एक एकीकृत तंत्र8मायावी रहता है । सक्रिय NLRP3 oligomerizes अपने NACHT डोमेन के बीच बातचीत के माध्यम से, और रंगरूटों ए एस सी pyrin (PYD) डोमेन13के बंधन के द्वारा । प्रत्येक कक्ष में, ये macromolecular कॉम्प्लेक्स एक एकल microscopically दृश्यमान फ़ोकस बनाते हैं. ए एस सी मूल रूप से एक 22 केडीए प्रोटीन है कि मानव लेकिमिया कोशिकाओं के apoptosis के दौरान एक “धब्बा” रूपों के रूप में पहचान की थी, और नाम apoptosis-जुड़े धब्बा एक कार्ड14युक्त प्रोटीन की तरह । यह बाद में निर्धारित किया गया था कि ए एस सी रंगरूटों प्रो-caspase-1 के कार्ड के साथ ए एस सी के कार्ड की बातचीत के माध्यम से प्रो caspase-1, inflammasome15के गठन ।
नहीं सभी NLRs caspase-1 सक्रियण प्रेरित करने के लिए ए एस सी की उपस्थिति की आवश्यकता होती है । NLRP3 के विपरीत, NLRC4 और NLRP1b कार्ड डोमेन है और सीधे प्रो-caspase-कार्ड के माध्यम से 1 भर्ती कर सकते है कार्ड बातचीत caspase-1 सक्रियण प्रेरित करने के लिए । ए एस सी के अभाव में, सक्रिय caspase-1 cytosol भर में फैलाना रहता है और एक भी ध्यान केंद्रित फार्म नहीं है । इस फैलाना सक्रिय caspase-1 pyroptotic कोशिका मौत के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन समर्थक IL-1β13,16प्रक्रिया करने में असमर्थ है ।
इस पांडुलिपि में हम inflammasome सक्रियण का आकलन करने के लिए दो तरीकों पर चर्चा करेंगे । सबसे पहले फ्लोरोसेंट गतिविधि जांच का उपयोग करता है, FAM-YVAD-FMK, जो caspase-1 परिवार को चिढ़ाता बांधता है । इस परिवार में caspase-1, लेकिन इसके अलावा माउस caspase-11 और ह्यूमन caspase-4 और caspase-5 शामिल हैं । सभी प्रयोगों में caspase-1/11 आपुर्ति चूहों से मैक्रोफेज का उपयोग करके, इस जांच की विशिष्टता को संबोधित किया जाएगा । इस विधि inflammasome घटकों के एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ जोड़ा जा सकता है, जो हम भी वर्णन करेंगे । सूक्ष्म विज़ुअलाइज़ेशन सक्रिय caspase-1 और oligomerized ए एस सी युक्त व्यक्तिगत कोशिकाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है । इस विधि का प्रयोग, शोधकर्ताओं ने निर्धारित करने में सक्षम हो जाएगा, जहां inflammasome गठन झरना मेजबान सेल के अपने जोड़तोड़ या अध्ययन के तहत रोगजनक जीव एक प्रभाव है । उदाहरण के लिए, एक अंतर कर सकते है कि एक दिया हस्तक्षेप NLRP3 परिसर में ए एस सी की भर्ती को रोकता है या बाद में भर्ती और caspase के सक्रियकरण-117लक्ष्य । caspase-1 सक्रियकरण के परिणामों की जांच ऐसे IL-1β स्राव के रूप में इन दो संभावनाओं के बीच अंतर करने में सक्षम नहीं होगा । इसके अलावा, IL-1β का स्राव caspase-1 को सक्रिय करने और pyroptotic कोशिका मृत्यु16से गुजरना करने की क्षमता कोशिकाओं को बदलने के बिना बदला जा सकता है ।
दूसरी विधि सेल supernatant, जो pyroptotic मैक्रोफेज lysis निंनलिखित caspase-1 के रूप में ऊपर वर्णित सक्रियण के दौरान होता है में स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) की रिहाई के उपाय । यह दूसरी विधि है एक जनसंख्या आधारित दृष्टिकोण के रूप में LDH की रिहाई में पूरी तरह से मापा जाता है । इस सरल दृष्टिकोण तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देता है (गर्मी समय के 30 मिनट) नमूनों की निर्धारित करने के लिए अगर वहां है caspase-1-मध्यस्थ सेल मौत और एक ९६-well प्लेट प्रारूप में किया जा सकता है ।
इन तरीकों पूरक हैं, विभिंन लाभों के साथ प्रत्येक, और दोनों आसानी से संशोधनों के लिए उत्तरदाई हैं । उदाहरण के लिए, लक्षित छोटे आणविक वजन inflammasome उत्तेजना से पहले यौगिकों के साथ मैक्रोफेज उपचार भूमिका कुछ प्रोटीन भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने पर हो सकता है की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम inflammasome सक्रियण की जांच करने के लिए दो तकनीक प्रस्तुत किया है और murine अस्थि मज्जा में NLRP3 उत्तेजना के बाद caspase-1 सक्रियण के परिणाम-मैक्रोफेज व्युत्पंन । पहली तकनीक की अनुमति देता है शोधकर्त?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सभी माइक्रोस्कोपी Nathaniel पीटर्स के समर्थन के साथ और NIH पुरस्कार S10OD016240 के समर्थन के साथ डब्ल्यू एम उबकना माइक्रोस्कोपी केंद्र पर किया गया था । S.L.F. NIH K08AI119142 और R21AI130281 द्वारा समर्थित है । हम डॉ रिचर्ड Flavell और डॉ ब्रैड Cookson caspase-1/11 की कमी चूहों के लिए धंयवाद, और डॉ ब्राड Cookson प्रयोगशाला सुविधाओं और उपकरणों के बंटवारे के लिए ।
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
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