Deteksjon av Inflammasome aktivisering og Pyroptotic celle død i Murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager
Summary
Vi beskriver gjenkjenning av NLRP3 inflammasome aktivisering på cellular basis benytter fluorescens mikroskopi og flekker for aktive caspase-1 og adapteren, ASC. En laktat dehydrogenase utgivelsen analysen er presentert for å oppdage pyroptotic lyse på befolkningen basis. Disse teknikkene kan tilpasses for å studere mange aspekter av inflammasome biologi.
Abstract
Inflammasomes er medfødte immunsystemet signalnettverk plattformer som kreves for vellykket kontroll av mange sykdomsfremkallende organismer, men også fremme provoserende og autoinflammatory sykdommer. Inflammasomes aktiveres ved cytosolic mønster anerkjennelse reseptorer, inkludert medlemmer av NOD-lignende reseptor (Review) familien. Disse reseptorene oligomerize ved påvisning av mikrobiell- eller skader-assosiert stimuli. Påfølgende rekruttering av adapter protein ASC danner en mikroskopisk synlig inflammasome komplekset, som aktiverer caspase-1 til nærhet-indusert Autoaktivering. Etter aktivisering kløyver caspase-1 pro-IL-1β og pro-IL-18, fører til aktivering og sekresjon av disse pro-inflammatoriske cytokiner. Caspase-1 formidler også inflammatorisk form av celledød kalt pyroptosis, som har tapet av membran integritet og celle lysis. Caspase-1 kløyver gasdermin D, slippe N-terminal fragmentet som plasma membranen porene, fører til osmotisk lysis.
I vitro, aktivering av caspase-1 kan bestemmes ved merking Ben margtransplantasjon-avledet makrofager med caspase-1 aktivitet sonden FAM-YVAD-FMK og merking cellene med antistoffer mot adapter protein ASC. Denne teknikken tillater identifisering av inflammasome formasjon og caspase-1 aktivering i enkeltceller bruker fluorescens mikroskopi. Pyroptotic celledød kan oppdages ved å måle utgivelsen av cytosolic laktat dehydrogenase til medium. Denne fremgangsmåten er enkel, kostnadseffektiv og utført i 96-brønnen plate format, slik at tilpasning for screening. I dette manuskriptet viser vi at aktivering av NLRP3 inflammasome av nigericin fører co oversetting av adapter protein ASC og aktive caspase-1, fører til pyroptosis.
Introduction
Inflammasome-mediert betennelse er en kritisk komponent i forsvaret mot sykdomsfremkallende organismer1, men også ligger under etiologien for mange sykdommer2. Inflammatorisk reaksjon på en rekke infeksjoner utløses av cytosolic påvisning av patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs) eller skade forbundet molekylær mønster (DAMPs). Mønster gjenkjennelse reseptorer (PRR), inkludert medlemmer av NOD-lignende reseptor (Review) familien, oligomerize ved påvisning av disse PAMPs og DAMPs. Dette utløser dannelsen av et multi protein kompleks kalt inflammasome, som inneholder PRR, adapter protein apoptose-assosiert flekk som protein inneholder et C-terminalen caspase-rekruttering domene (kort) (ASC) og Pro form av caspase-13,4. Dette gir nærhet-indusert auto-aktivering av caspase-1. Aktive caspase-1 da fører til et sett med hendelser som er karakteristiske for inflammatorisk celle død veien pyroptosis. Disse hendelsene inkluderer: cleavage og utgivelsen av inflammatoriske cytokiner IL 1β og IL-18, lysosome exocytosis med utgivelsen av lysosomale innholdet i ekstracellulære plass, kjernefysiske kondens og gasdermin D cleavage. Utgitt N-terminal domenet gasdermin D setter inn i plasma membranen, danne porer at plasma membranen brudd og frigjøring av inflammatoriske innholdet, i tillegg til å ta bort en beskyttende nisje for patogen replikering5, 6 , 7.
Her fokusere vi på godt studert NLRP3 inflammasome. Aktivering av NLRP3-inflammasome skjer via en totrinns prosess8. Steg 1 “grunning” skjer gjennom erkjennelsen av Toll-like reseptorer (TLR) mikrobiell produktet. Dette er replikert i innstillingen laboratorium ved hjelp av LPS for å stimulere TLR4. Dette stimulering upregulates NLRP3 og pro-IL-1β gjennom NF-kB signalering. Grunning i tillegg lisenser NLRP3 gjennom ikke-transcriptional mekanismer ved å indusere sin deubiquitination9,10 og fosforylering eller dephosphorylation bestemt rester11,12.
Andre signalet for NLRP3 aktivisering antas å involverer Mitokondrielt faktorer, reaktive oksygen arter, kalium middelklasseinnbyggere og kalsium signalnettverk, selv om en samlende mekanisme for NLRP3 aktivisering forblir unnvikende8. Aktivert NLRP3 oligomerizes gjennom interaksjoner mellom sin NACHT domener, og rekrutterer ASC via binding av pyrin (PYD) domener13. I hver celle danner disse macromolecular komplekser enkelt mikroskopisk synlig fokus. ASC ble opprinnelig identifisert som en 22 KDa protein som danner en “prikk” under apoptose menneskers leukemi celler og navngitt apoptose-assosiert flekk som protein inneholder en kort14. Det ble senere fastslått at ASC rekrutterer pro-caspase-1 til samspillet av kortet av ASC kortet pro-caspase-1, danner de inflammasome15.
Ikke alle NLRs krever ASC å indusere caspase-1 aktivisering. I motsetning til NLRP3, NLRC4 og NLRP1b har kort domener og kan direkte rekruttere pro-caspase-1 via kort-kort interaksjoner å indusere caspase-1 aktivisering. I fravær av ASC, aktive caspase-1 forblir diffus gjennom stoffer og utgjør ikke en enkelt fokus. Denne diffuse aktive caspase-1 er tilstrekkelig til å indusere pyroptotic celledød, men kan ikke behandle pro-IL-1β13,16.
I dette manuskriptet vil vi diskutere to måter å vurdere inflammasome aktivisering. Først bruker fluorescerende aktiviteten sondere, FAM-YVAD-FMK, som binder caspase-1 familie proteaser. Denne serien inkluderer caspase-1, men også musen caspase-11 og menneskelig caspase-4 og caspase-5. Ved hjelp av makrofager fra caspase-1/11 mangelfull mus i alle eksperimentene, sendes spesielle ved denne sonde. Denne metoden kan kombineres med antistoff merking av inflammasome komponenter, som vi også beskriver. Mikroskopiske visualisering tillater identifikasjon av individuelle celler som inneholder aktive caspase-1 og oligomerized ASC. Bruker denne metoden, vil forskere kunne finne ut hvor i inflammasome formasjon kaskade deres manipulering av verten cellen eller den sykdomsfremkallende organismen under studien har en effekt. For eksempel kan man skille om en gitt intervensjon forhindrer rekruttering av ASC NLRP3 komplekse eller mål påfølgende rekruttering og aktivering av caspase-117. Undersøke resultatene av caspase-1 aktivisering som IL-1β sekresjon kunne ikke skille mellom disse to muligheter. Utskillelsen av IL-1β kan også endres uten å endre celler muligheten til å aktivere caspase-1 og gjennomgå pyroptotic celle død16.
Den andre metoden måler utgivelsen av laktat dehydrogenase (LDH) inn i cellen supernatant, som oppstår under pyroptotic macrophage lysis etter caspase-1 aktivisering som beskrevet ovenfor. Denne andre metoden er en populasjon basert tilnærming utgivelsen av LDH i hele godt er målt. Denne enkle tilnærming tillater rask analyse (30 min incubation tid) av prøver å avgjøre om det er caspase-1-mediert celledød og kan utføres i 96-brønnen plate format.
Disse metodene er komplementære, hver med forskjellige fordeler, og begge er lett mottakelig for endringer. Macrophage behandling med målrettet små molekylvekt forbindelser før inflammasome stimulering kan for eksempel brukes til å undersøke hvilken rolle visse proteiner kan ha på kontrollere inflammatorisk svar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskriptet har vi presentert to teknikker for å undersøke inflammasome aktivisering og konsekvensen av caspase-1 aktivisering etter NLRP3 stimulering i murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager. Den første teknikken gjør forskeren å bestemme nivået av caspase-1 aktivisering på cellular basis med fluorescerende reporteren FAM-YVAD-FMK. Denne reporteren er svært spesifikke for bindende caspase-1 familien av enzymer som sett av fraværet av farging i caspase-1/11 mangelfull makrofager. Spesifisitet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle mikroskopi ble gjort på W. M. Keck mikroskopi Center med støtte av Nathaniel Peters og med støtte av NIH award S10OD016240. S.L.F. støttes av NIH K08AI119142 og R21AI130281. Vi takker Dr. Richard Flavell og Dr. Brad Cookson for caspase-1/11 mangelfull mus, og Dr. Brad Cookson for deling laboratoriefasiliteter og utstyr.
Materials
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | For growing L929 cells |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer. Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde |
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay | Fisher Scientific | PR-G1780 | Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Invitrogen | 31053028 | |
| Dulbecco's PBS, no calcium, no magnesium | Invitrogen | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin | Invitrogen | 26140079 | Heat inactivated at 55°C for 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46 |
| goat anti-mouse ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodide | Invitrogen | T3605 | far-red fluorescent nucleic acid stain |
| C57BL/6J mouse | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- mouse | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Confocal Microscope | Leica | ||
| Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| anti-ASC clone 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-ethanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 plate reader | Molecular Devices | 5000414 |
Referências
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677-687 (2015).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., Cookson, B. T. Pyroptosis: host cell death and inflammation. Nat Rev Microbiol. 7 (2), 99-109 (2009).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cell Microbiol. 8 (11), 1812-1825 (2006).
- Bergsbaken, T., Fink, S. L., den Hartigh, A. B., Loomis, W. P., Cookson, B. T. Coordinated host responses during pyroptosis: caspase-1-dependent lysosome exocytosis and inflammatory cytokine maturation. J Immunol. 187 (5), 2748-2754 (2011).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Sutterwala, F. S., Haasken, S., Cassel, S. L. Mechanism of NLRP3 inflammasome activation. Ann N Y Acad Sci. 1319, 82-95 (2014).
- Juliana, C., et al. Non-transcriptional priming and deubiquitination regulate NLRP3 inflammasome activation. J Biol Chem. 287 (43), 36617-36622 (2012).
- Py, B. F., Kim, M. S., Vakifahmetoglu-Norberg, H., Yuan, J. Deubiquitination of NLRP3 by BRCC3 critically regulates inflammasome activity. Mol Cell. 49 (2), 331-338 (2013).
- Song, N., et al. NLRP3 Phosphorylation Is an Essential Priming Event for Inflammasome Activation. Mol Cell. 68 (1), 185-197 (2017).
- Stutz, A., et al. NLRP3 inflammasome assembly is regulated by phosphorylation of the pyrin domain. J Exp Med. 214 (6), 1725-1736 (2017).
- Broz, P., Dixit, V. M. Inflammasomes: mechanism of assembly, regulation and signalling. Nat Rev Immunol. 16 (7), 407-420 (2016).
- Masumoto, J., et al. ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells. J Biol Chem. 274 (48), 33835-33838 (1999).
- Yamamoto, M., et al. ASC is essential for LPS-induced activation of procaspase-1 independently of TLR-associated signal adaptor molecules. Genes Cells. 9 (11), 1055-1067 (2004).
- Miao, E. A., Rajan, J. V., Aderem, A. Caspase-1-induced pyroptotic cell death. Immunol Rev. 243 (1), 206-214 (2011).
- LaRock, C. N., Cookson, B. T. The Yersinia virulence effector YopM binds caspase-1 to arrest inflammasome assembly and processing. Cell Host Microbe. 12 (6), 799-805 (2012).
- Swanson, M. S., Isberg, R. R. Association of Legionella pneumophila with the macrophage endoplasmic reticulum. Infect Immun. 63 (9), 3609-3620 (1995).
- Miller, S. I., Ernst, R. K., Bader, M. W. LPS, TLR4 and infectious disease diversity. Nat Rev Microbiol. 3 (1), 36-46 (2005).
- Sester, D. P., et al. A novel flow cytometric method to assess inflammasome formation. J Immunol. 194 (1), 455-462 (2015).
- Sester, D. P., et al. Assessment of Inflammasome Formation by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2016).
- DiPeso, L., Ji, D. X., Vance, R. E., Price, J. V. Cell death and cell lysis are separable events during pyroptosis. Cell Death Discov. , (2017).
- Russo, H. M., et al. Active Caspase-1 Induces Plasma Membrane Pores That Precede Pyroptotic Lysis and Are Blocked by Lanthanides. J Immunol. 197 (4), 1353-1367 (2016).
- Evavold, C. L., et al. The Pore-Forming Protein Gasdermin D Regulates Interleukin-1 Secretion from Living Macrophages. Immunity. , (2017).
