Retrospektiv mikroRNA sekvensering: Kompletterande DNA bibliotek förberedelse protokoll använder Formalin-fast Paraffin-inbäddat RNA exemplar
Summary
Formalin-fast paraffin-inbäddat exemplar representerar en värdefull källa av molekylära markörer av mänskliga sjukdomar. Här presenterar vi ett laboratoriebaserade cDNA bibliotek förberedelse protokoll, ursprungligen utformad med färsk fryst RNA och optimerad för analysen av arkiverade mikroRNA från vävnader lagras upp till 35 år.
Abstract
– Arkiveras, kliniskt klassificeras formalin-fast kan paraffin-inbäddat (FFPE) vävnader ge nukleinsyror för retrospektiv molekylära studier av cancerutveckling. Med hjälp av icke-invasiva eller pre-maligna lesioner från patienter som senare utvecklar invasiv sjukdom, kan gen uttryck analyser identifiera tidiga molekylära förändringar som predisponerar för cancerrisk. Det har beskrivits väl att nukleinsyror återhämtat sig från FFPE vävnader har genomgått allvarliga fysiska skador och kemiska modifieringar, vilket försvårar deras analys och allmänt kräver anpassade analyser. MikroRNA (Mirna), dock som föreställer en liten klass av RNA-molekyler som spänner endast upp till ~ 18 – 24 nukleotider, har visat sig tåla långvarig lagring och framgångsrikt har analyserats i FFPE prover. Här presenterar vi en 3′ barcoded kompletterande DNA (cDNA) bibliotek förberedelse protokoll specifikt optimerad för analys av små RNAs utvinns ur arkiverade vävnader, som visades nyligen för att vara robust och mycket reproducerbara när använda arkiveras kliniska prover lagras i upp till 35 år. Detta bibliotek preparat är väl anpassade till multiplex analysen av nedsatt/försämrad material där RNA prover (upp till 18) är sammanskrivna med enskilda 3′ barcoded adaptrar och sedan poolade tillsammans för efterföljande enzymatisk och biokemiska preparat före analys. Alla reningar utförs av polyakrylamid gelelektrofores (sidan), som tillåter storlek-specifika val och rikedomar av barcoded små RNA arter. Detta cDNA bibliotek preparat är väl anpassade till minuten RNA ingångar, som en pilot polymeras-kedjereaktion (PCR) tillåter bestämning av en specifik amplifiering cykel att producera optimala mängder material för nästa generations sekvensering (NGS). Detta tillvägagångssätt var optimerad för användning av försämrade FFPE RNA från prover som sparas i upp till 35 år och ger mycket reproducerbara NGS data.
Introduction
MicroRNA är anmärkningsvärt väl bevarad i formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) exemplar1,2,3. Tidigare arbete har visat att uttrycket av dessa kort reglerande icke-kodande enda stranded RNA-molekyler kan utvärderas framgångsrikt använder total-RNA från FFPE prover och tillhandahålla relevanta gen uttryck data jämfört med det ursprungliga färskt vävnaderna4,5,6,7,8. Jämfört med stora messenger RNAs, som har visat sig påverkas kritiskt av FFPE vävnad behandling (formaldehyd, värme, uttorkning, etc.), endogena RNaser och ålder av exemplar, den lilla storleken på MicroRNA (~ 18 – 24 nukleotider) visas att göra dem resistenta mot nedbrytning och motståndskraftig till långsiktig lagring, också visat genom miRNA uttryck studier som överträffar högt dataflöde mRNA studier i arkiverade exemplar9. miRNA uttryck studier med arkiverade kliniska prover, som har mestadels utförts i småskaliga analyser, har visat att enstaka eller multiplexed kvantitativa PCR-analyser, olika typer av microarray technologies, och mest nyligen NGS kan användas för att utvärdera uttrycket av bevarade MicroRNA efter optimering av dessa analyser10,11,12,13,14.
Med tanke på att dysreglering av miRNA uttryck har associerats med utvecklingen av en mängd mänskliga maligniteter och att det finns potentiellt ett enormt utbud av kliniskt kommenterad arkiverade exemplar, det har blivit uppenbart att dessa små RNA molekyler utgör en lovande potentiell cancer biomarkörer15,16,17,18. Användning av en hög genomströmning gen uttryck teknik såsom NGS har fördelen av att ge en global utvärdering av alla miRNA avskrifter jämfört med riktade teknik såsom PCR eller microarrays19. Av denna anledning, var en optimerad, prisvärt och enkelt tillämpliga protokoll för cDNA bibliotek beredning av små RNAs från äldre arkiverade prover för NGS optimerad för att möjliggöra storskalig retrospektiva studier20.
Tidigare etablerade vi ett samtidiga RNA/DNA extraktion protokoll för separat återvinning av RNA och DNA från äldre arkiverade exemplar, som vi hittade för att överträffa modern kommersiella kit21. Använder detta extraktion protokoll, för att få total-RNA från FFPE-vävnad arkiveras under längre tider, optimerat vi utarbetandet av cDNA bibliotek för NGS av MicroRNA bevaras i kliniska prover för upp till 35 år. Dessutom i en nyligen publicerad studie var vi beredda cDNA bibliotek från kliniskt sekretessbelagda ductal carcinoma i situ (DCIS) exemplar, identifierade vi Differentiellt uttryckta MicroRNA som validerades av kvantitativa PCR, som anges att specifika miRNA uttryck förändringar kan upptäckas i DCIS lesioner från patienter som utvecklar bröstcancer jämfört med DCIS lesioner från patienter som inte utvecklar bröstcancer.
Med tanke på kostnaden för kommersiella kit för beredning av små RNA cDNA bibliotek, potentialen för deras utsättning, samt användningen av upphovsrätt/patentskyddade reagenser som inte kan optimeras, beslutade vi att anpassa en tidigare publicerade laboratoriebaserade och kit-gratis 3′ barcoded cDNA bibliotek förberedelse protocol for NGS av små RNAs arkiveras i FFPE exemplar som möjliggör samtidig analys av 18 prover22. Detta protokoll ger en idealisk och robust stegvisa förfarande med visuella och tekniska utvärderingen kontrollpunkter, som var kritiska för anpassning till FFPE RNA exemplar, och har en stor tillväxtpotential för att andra källor till komprometterad eller svårt att använda RNA material. Ursprungliga protokollets tillämpning förbättrades genom att ersätta radioaktivt märkta storlek markörer med lysrör (t.ex., SYBR guld) detekterbara RNA storlek-markörer som används vid urval av sammanskrivna bibliotek på stora polyakrylamidgeler. Optimerad protokollet bygger på ligering av 3′ barcoded adaptrar för 18 enskilda FFPE RNA exemplar, som utgör då poolade tillsammans för att genomgå 5′ adapter ligatur, omvänd-Transkription, och en pilot PCR analys för skräddarsydda förstärkning av den slutliga cDNA bibliotek före storskaliga PCR-amplifiering, rening och NGS på en hög genomströmning sequencer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett mycket reproducerbara och robust cDNA bibliotek förberedelse protokoll för NGS av små RNAs arkiveras i FFPE RNA exemplar presenteras i detta protokoll, som är en modifierad och optimerad version av det förfarande som beskrivs av Hafner o.a. 22
Alla steg i detta protokoll har optimerats för användning med äldre arkiverade och komprometterad total-RNA återhämtat sig från FFPE exemplar. Det viktigaste steget i detta protokoll, för bearbetning av sm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Thomas Tuschl, chef för laboratoriet för RNA molekylärbiologi, samt medlemmar i hans laboratorium för deras stöd och för att dela den teknik som utvecklats i hans laboratorium och ger tillgång till rörledningen RNAworld. Vi tackar också Dr. Markus Hafner för att dela hans protokoll och ge detaljerade beskrivningar på alla biokemiska och enzymatiska steg som används i hans ursprungliga förfarandet.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
- Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure–DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
- Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
- Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
- Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
- Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
- Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
- Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
- Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
- Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
- Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
- Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
- Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
- Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
- Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
- Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
- Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
- Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
- Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
- Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
- Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
- Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).
