Desthiobiotin-Streptavidin-affinitet medieret oprensning af RNA-interagere proteiner i Mesotheliom celler

Summary

Desthiobiotin mærkning af en syntetisk oligo 25-nukleotid RNA, som indeholder en adenin-rige element (er) motiv, tillader specifikke bindende cytosole er-bindende protein.

Abstract

In vitro- RNA-pulldown anvendes stadig i vid udstrækning i de første trin af protokoller med henblik på at identificere RNA-bindende proteiner, der anerkender bestemt RNA strukturer og motiver. I protokollens RNA-pulldown kommercielt syntetiserede RNA-sonder er mærket med en modificeret form af biotin, desthiobiotin, fra 3′ endepunktet af RNA-streng, der kan dekrypteres binder sig til streptavidin og dermed giver eluering af proteiner under mere fysiologisk betingelser. RNA-desthiobiotin er immobiliseret gennem interaktion med streptavidin på magnetiske perler, som bruges til at trække ned proteiner, der specifikt interagerer med RNA af interesse. Ikke-denatureret og aktive proteiner fra det cytosole brøkdel af lungehindekræft celler der bruges som kilde til proteiner. Metoden beskrives her kan anvendes til påvisning af samspillet mellem kendte RNA-bindende proteiner og en 25-nukleotid (nt) lang RNA sonde der indeholder en sekvens af interesse. Dette er nyttigt til at fuldføre den funktionelle karakterisering af stabiliserende eller destabiliserende elementer findes i RNA molekyler opnås ved hjælp af en reporter vektor assay.

Introduction

Genekspression og det endelige niveau for gen produktet kan reguleres tæt ved at påvirke mRNA stabilitet og mRNA oversættelse sats¹. Disse post-transcriptional reguleringsmekanismer er udøvet gennem vekselvirkninger mellem ikke-kodende RNA og/eller RNA-bindende proteiner (RBPs) med målrettede mRNA. Det er normalt den 3′ utranslaterede region af mRNA (3′ UTR – tilhører den ikke-kodende del af genom²) der indeholder specifikke cis-regulerende elementer (CRE), som er anerkendt af trans-handler faktorer såsom miRNA eller RBPs ³. den bedst undersøgte cis-element inden for 3′ UTR, er motivet er adenin-rige element (er), som er anerkendt af specifikke AU-bindende proteiner (AUBP), og til gengæld, inducerer enten mRNA nedbrydning/deadenylation (er-medieret decay) eller mRNA stabilisering⁴.

Størrelsen af 3′ UTR af calretinin mRNA (CALB2) er 573 bp lang og indeholder en formodede AUUUA pentamer, som forudsagt af AREsite2, en bioinformatic værktøj⁵. Overensstemmelse med tilstedeværelsen af en formodet er motiv, pmirGLO vektor-reporter Analysen viste en stabilisering rolle af dette element inden for CALB2 mRNA⁶. Endelig, in vitro- RNA-pulldown blev brugt til at identificere den AUBP, der stabiliserer calretinin mRNA gennem er motiv.

Da alle ikke-kodende RNA’er interagerer med proteiner⁷, in vitro- RNA-pulldown er en god måde og første of choice analyse for at identificere RNA-interactors til støtte i afkodningen molekylære mekanismer. I denne RNA-pulldown metode, blev kommercielt syntetiserede RNA-sonder, der var mærket med en modificeret form af biotin (desthiobiotin) fra 3′ endepunktet af RNA-streng, anvendt. RNA-desthiobiotin er immobiliseret gennem interaktion med streptavidin på magnetiske perler, som bruges til at trække ned proteiner, der specifikt interagerer med bundet-RNA af interesse. Ikke-denatureret og aktive proteiner fra det cytosole brøkdel af lungehindekræft celler der bruges som kilde til proteiner. Disse RNA-bundet proteiner er elueret fra de magnetiske perler, køre gennem en 12% SDS-PAGE gel, overføres til en membran og aftestede med forskellige antistoffer.

I standard streptavidin-biotin affinitet rensning procedure, barske denaturering betingelser er nødvendige for at forstyrre den stærke irreversibel biotin-streptavidin bånd for at eluere bundne proteiner⁸, hvilket kan føre til dissociation af proteinkomplekser. I modsætning til biotin, desthiobiotin reversibelt bindes til streptavidin og er konkurrencedygtig forskydes med en bufferopløsning af biotin, giver mulighed for en blid eluering af proteiner, og at undgå isolation af naturligt biotinylated molekyler⁹, tyder på, at teknikken er ideel til at isolere nativt proteinkomplekser indfødte betingelser.

In vitro bindende betingelser og strenghed, som bestemmes af saltkoncentration, reduktionsmiddel og vaskemiddel procentdel, bør være tæt på de tilstedeværende i forbindelse med cellulære for at identificere sande i vivo interaktioner. De bindende betingelser gennemført heri har tidligere påvist som passende for en identifikation af HuR som en AU-bindende protein¹⁰. Denne tilgang kunne spare tid, da optimering af ordentlig bindende betingelser kan være tidskrævende og udfordrende. Desuden, denne metode kunne anvendes som en start protokol for enhver RNA-pulldown eksperiment og gradvist kan optimeres ved at ændre koncentration af salte og rengøringsmidler, ændre glycerol procentdelen og tilføje andre salte. Vi viste desuden, at selv en kort 25-nukleotid RNA-sonde husly en pentamer er-motiv kan bruges til at vise interaktion med en specifik AUBP.

Protocol

1. forberedelse af cytosole og nukleare proteinfraktion Plade 4 x 106 ACC-MESO-4 celler i en T150 celle kultur kolbe dyrkes i RPMI – 1640 medium suppleret med 10% FBS, 1 x penicillin/streptomycin (100 x) og 2 mM L-glutamin (200 mM). Når celler når et sammenløb af 80-90% (~5-5.5 x 106 celler), fortsætte med protein udvinding af nukleare og cytosole brøkdel.Bemærk: ACC-MESO-4 cellelinie blev indhentet fra RIKEN BioResource Center11. Opsug medium, v…

Representative Results

I dette eksperiment, blev en 25-nt lang fragment af calretinin 3′ UTR husly er motiv (CALB2 3′ UTR (er) 25-nt) brugt til at teste, om det binder sig specifikt til den menneskelige-antigen Rasmussen (HuR) protein, en kendt mRNA stabilisator. For at teste specificiteten af elementet er, en 25-nt RNA var sonden CALB2 3′ UTR (mtARE) indeholdende en er-motiv mutation, som tidligere blev vist at afskaffe stabilisering effekten er motiv, brugte6. Den tredje RNA sonde repr…

Discussion

3′ UTRs tilhører ikke-kodende genom³, og alle ikke-kodende RNA’er kan interagere med proteiner for at udøve deres funktion⁷. Når det mammale genom blev anset for at være korrekt transskriberet og produceret en betydelig del af lange noncoding RNA’er¹⁶, viste nye beviser, at disse lange-noncoding RNA’er fungere i reguleringen genekspression som de interagerer med kromatin-remodeling komplekser¹⁷. Denne viden blev opnået ve…

Materials

NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit	Thermo Fisher Scientific	20163	The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C).
DynaMag-2,  magnetic stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	–	The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody	Cell Signaling	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody	Rockland	200-301-A87
Secondary goat anti-rabbit antibody	Cell Signaling	7074
Secondary rabbit anti-mouse antibody	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI – 1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
FBS – Filtrated Bovine Serum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin – streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutamine solution (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Glass Plates	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer	Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules	Bio-Rad	1658050
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
PVDF transfer membrane	Perkin Elmer	NEF1002	Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Digital Imager	Vilber	–
RNA oligo synthesis	Mycrosynth AG, Switzerland	–	the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile aliquots to be stored at -20°C
Pierce Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88817	Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate	Sigma-Aldrich	368458
ortho-phosphoric acid	Applichem	A0637