Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製
Summary
Desthiobiotin ラベル アデニンの豊富な要素 (は) モチーフが含まれている、合成 25 ヌクレオチド RNA oligo のゾル性細胞質が結合タンパク質の特異的結合をことができます。
Abstract
In vitro RNA プルダウン、まだ主目的で特定の RNA の構造とモチーフを認識 RNA 結合蛋白質を識別するプロトコルの最初の手順で使用されます。この RNA プルダウン プロトコルで市販合成 RNA プローブがビオチン、ストレプトアビジンに可逆的に結合しより下で蛋白質の溶出がように rna の 3′ 末端に、desthiobiotin の変更されたフォームと分類される生理条件。RNA desthiobiotin が特に関心の RNA と相互作用するタンパク質をプルダウンに使用される磁気ビーズのストレプトアビジンとの相互作用を介して固定します。中皮腫細胞の細胞質画分から非変性とアクティブな蛋白質は蛋白質のソースとして使用されます。ここで説明する方法は、知られている RNA 結合タンパク質との興味のシーケンスを含む 25 ヌクレオチド (nt) 長い RNA プローブ間の相互作用の検出に適用できます。これは安定しているか不安定要素ベクトル レポーターアッセイを使用して達成する RNA 分子の存在の機能の解析を完了するのに役立ちます。
Introduction
MRNA の安定性と mRNA 翻訳レート1に影響を与える遺伝子の発現と遺伝子産物の最後のレベルをしっかりと調節できます。非コーディングの RNA や RNA 結合タンパク質 (Rbp) の標的 mRNA との対話を通じてこれらの転写後調節機構が加わる。それは通常 (3′ UTR –2ゲノムの非コーディングの部分に属する) 特定cisを含む mRNA の 3′ 非翻訳領域-トランスによって認識される規制要素 (CRE)-miRNA や Rbp などの要因を演技3最高研究cis-3′ UTR、内の要素は、アデニンの豊富な要素 (は) モチーフには、特定の AU 結合蛋白質 (AUBP) し、順番が認識誘導か mRNA の分解/deadenylation (は崩壊) または。mRNA 安定4。
サイズ 3′ UTR カルレチニンの mRNA (CALB2) は 573 長い bp、AREsite2、bioinformatic ツール5によって予測された、推定 AUUUA いくつが含まれます。推定はモチーフの存在と一貫性のある、pmirGLO ベクトル レポーターアッセイ CALB2 mRNA6要素の安定化の役割を示した。最後にの in vitro RNA プルダウン カルレチニンが安定 AUBP を識別するために使用された mRNA はモチーフを。
すべての非コーディングの Rna とタンパク質7の対話、以来体外RNA プルダウンは分子メカニズムの解読を支援するための良い方法と RNA インターアクターを識別するための最初の選択の試金。この RNA プルダウン法市販合成 RNA プローブは、RNA 鎖の 3′ 末端をビオチン (desthiobiotin) の修正された形で付けられましたが使用されていました。RNA desthiobiotin が特に関心のバインド RNA と相互作用するタンパク質をプルダウンに使用される磁気ビーズのストレプトアビジンとの相互作用を介して固定します。中皮腫細胞の細胞質画分から非変性とアクティブな蛋白質は蛋白質のソースとして使用されます。このような RNA 結合タンパク質は、12 %sds ページのゲルを実行、膜に転送され、異なる抗体をプローブの磁気ビーズから溶出されます。
過酷な変性条件は8バインドされたタンパク質を溶出への強力な不可逆的なビオチン ストレプトアビジン結合を破壊するために必要な標準的なストレプトアビジン-ビオチン アフィニティ精製手順での解離を引き起こす可能性蛋白質の複合体。異なり、ビオチン、desthiobiotin は可逆的ストレプトアビジンにバインド、ビオチン、蛋白質の穏やかな溶出を可能にして当然のことながらビオチン化分子の9分離を回避するバッファー溶液で避難は競争力のあります。技法が原産の条件の下でネイティブ蛋白質の複合体を分離するために理想的なことを示唆しています。
体外結合条件と逼迫、塩濃度、還元剤、洗剤の割合によって決定されますが真生体内での相互作用を識別するために携帯電話のコンテキストで現在のものに近いはずです。本実装バインド条件実証されている以前 AU 結合タンパク質10として、ハーを識別するために適切です。このアプローチは、適切な結合条件の最適化は時間がかかり、挑戦をすることができますので、時間を節約できます。さらに、このメソッドは、任意の RNA プルダウン実験開始プロトコルとして使用することができる、塩と洗剤の濃度を変化させ、グリセリンの割合を変更して他の塩を追加することによって徐々 に最適化することができます。さらに、こともいくつをかくまっている短い 25 ヌクレオチド RNA プローブはモチーフに使える特定の AUBP との相互作用を示すデモンストレーションを行った。
Protocol
Representative Results
Discussion
3′ UTRs は非コーディング ゲノム3に属し、すべての非コード Rna 蛋白質7彼らの機能を発揮するために対話できます。哺乳類のゲノムは行き渡って転写されることがわかったし、長鎖非コード Rna16のかなりの部分を生成、これらの長い非コード Rna 機能と対話する遺伝子発現を調節することを示した証拠を新興クロマチン再構築複合体<sup class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、スイス国立科学財団 Sinergia グラント CRSII3 147697、財団毛皮アメリカ Krebsforschung、チューリッヒ Krebsliga によって支えられました。
Materials
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | – | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI – 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS – Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin – streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | – | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | – | the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
Referências
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