Desthiobiotin-Streptavidin-affinitet mediert rensing av RNA-samspill proteiner i Mesothelioma celler

Summary

Desthiobiotin merking av en syntetisk 25-nukleotid RNA oligo, som inneholder en adenine-rik element (er) motiv, kan bestemt binding av cytosolic er uforpliktende protein.

Abstract

Den i vitro RNA-nedtrekk brukes fortsatt i stor grad i de første trinnene i protokoller som tar sikte på å identifisere RNA-bindende proteiner som gjenkjenner bestemte RNA strukturer og motiver. I denne RNA-nedtrekk protokollen, kommersielt syntetisert RNA sonder er merket med en modifisert form av biotin, desthiobiotin, endestasjonen 3 RNA strand, som reversibel binder seg til streptavidin og dermed lar elueringsrør proteiner under mer fysiologiske forhold. RNA-desthiobiotin er immobilized gjennom samspill med streptavidin på magnetiske perler, som brukes til å trekke ned proteiner som spesielt samhandler med RNA rundt. Non-denaturert og aktiv proteiner fra cytosolic brøkdel av mesothelioma celler brukes som kilde til proteiner. Metoden beskrevet her kan brukes for å oppdage samspillet mellom kjent RNA bindende proteiner og en 25-nukleotid (nt) lang RNA sonde som inneholder en sekvens av interesse. Dette er nyttig å fullføre funksjonelle karakterisering av stabilisere eller destabilisere elementer i RNA molekyler ved hjelp av en reporter vektor analysen.

Introduction

Genuttrykk og endelig nivå av gene produktet kan være tett regulert av påvirker mRNA stabilitet og mRNA oversettelse rate¹. Disse post-transcriptional regulatoriske mekanismene er utøvde gjennom samhandling ikke-koding RNA og/eller RNA-bindende proteiner (RBPs) med målrettet mRNA. Det er vanligvis 3 uoversatt regionen mRNA (3′ UTR – tilhører delen ikke-koding av genomet²) som inneholder bestemte cis-regulatoriske elementer (Grobunn), som er anerkjent av trans-fungerende faktorer som miRNA eller RBPs ³. den best studerte cis-element i de 3′ UTR, er adenine-rik element (er) motivet, som er anerkjent av spesifikke AU-bindende proteiner (AUBP), og, igjen, induserer enten mRNA nedbrytning/deadenylation (er-formidlet decay) eller mRNA stabilisering⁴.

Størrelsen av den 3-‘ UTR i av calretinin mRNA (CALB2) er 573 bp lang og inneholder en antatte AUUUA pentamer, som spådd av AREsite2, en bioinformatic verktøyet⁵. Samsvar med tilstedeværelse av antatte er motivet, pmirGLO vektor-reporter analysen viste en stabilisering rolle av dette elementet i CALB2 mRNA⁶. Til slutt, den i vitro RNA-nedtrekk ble brukt til å identifisere AUBP som stabiliserer calretinin mRNA gjennom er motivet.

Siden alle ikke-koding RNAs samhandle med proteiner⁷, den i vitro RNA-rullegardinmenyen er en god måte og første av valget analysen identifisere RNA-interaktører å hjelpe tyde molekylære mekanismer. I denne metoden er RNA-rullegardinmenyen, ble kommersielt syntetisert RNA sonder, som ble merket med en modifisert form av biotin (desthiobiotin) på 3 terminus RNA strand, brukt. RNA-desthiobiotin er immobilized gjennom samspill med streptavidin på magnetiske perler, som brukes til å trekke ned proteiner som spesielt samhandler med bundet-RNA rundt. Non-denaturert og aktiv proteiner fra cytosolic brøkdel av mesothelioma celler brukes som kilde til proteiner. Slike RNA-bundet proteiner er elut fra de magnetiske perlene, kjøre gjennom en 12% SDS side gel, overført til en membran og analysert med forskjellige antistoffer.

I den standard streptavidin-biotin affinity rensing prosedyren, harde rødsprit betingelsene må være forstyrre sterk irreversibel biotin-streptavidin bånd for å elute bundet proteiner⁸, som kan føre til av protein komplekser. I motsetning til biotin, desthiobiotin reversibel binder seg til streptavidin og er konkurransedyktig fordrevet med en bufferløsning til biotin, gir milde tilsettes proteiner, og unngå isolering av naturlig biotinylated molekyler⁹, antyder at teknikken er ideelt for å isolere innfødt protein komplekser under innfødt forhold.

In vitro bindende betingelser og stringens, som bestemmes av saltkonsentrasjon, reduksjonsmidler og vaskemiddel prosent, bør være nær de tilstedeværende i mobilnettet sammenheng for å identifisere ekte i vivo interaksjoner. Bindende betingelser implementert her har tidligere vist som passer til å identifisere HuR som en AU-bindende protein¹⁰. Denne tilnærmingen kan spare tid, siden optimalisering av riktig bindende betingelser kan være tidkrevende og utfordrende. Dessuten, denne metoden kan brukes som en start protokoll for noen RNA-nedtrekk eksperimentet og gradvis kan optimaliseres ved å endre konsentrasjon av salter og vaskemidler, endre ønsket glyserol og legge til andre salter. Videre har vi vist at selv en kort 25-nukleotid RNA-sonde skjuler en pentamer er-motiv kan brukes til å vise interaksjon med en bestemt AUBP.

Protocol

1. utarbeidelse av Cytosolic og kjernefysiske Protein fraksjon Plate 4 x 106 ACC-MESO-4 celler i en T150 celle kultur kolbe dyrket i RPMI – 1640 medium supplert med 10% FBS, 1 x penicillin/streptomycin (100 x) og 2 mM L-glutamin (200 mM). Når celler når en samløpet av 80-90% (~5-5.5 x 106 celler), Fortsett med protein utvinning av kjernefysiske og cytosolic fraksjon.Merk: ACC-MESO-4 celle linje er Hentet fra RIKEN BioResource sentrum11. Sug opp medi…

Representative Results

I dette eksperimentet, ble en 25-nt lang fragment av calretinin 3 UTR harboring er motivet (CALB2 3′ UTR (er) 25-nt) brukt til å teste om det binder seg spesifikt til Human-antigen R (HuR) protein, en kjent mRNA stabilisator. For å teste spesifisitet er elementet, en 25-nt RNA var sonde CALB2 3′ UTR (mtARE) som inneholder et er-motiv mutasjon, som tidligere viste seg å avskaffe stabilisering effekten av er motivet, brukt6. Den tredje RNA sonde representerer nega…

Discussion

3 UTRs tilhører ikke-koding genomet³, og alle ikke-koding RNAs kan samhandle med proteiner for å øve deres funksjon⁷. Når pattedyr genomet ble funnet å være pervasively transkribert og produsert en betydelig del av lang noncoding RNAs¹⁶, nye bevis har vist at disse lange-noncoding RNAs fungerer i å regulere genuttrykk når de samhandler med chromatin-remodeling komplekser¹⁷. Denne kunnskapen ble oppnådd ved hjelp av RN…

Materials

NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit	Thermo Fisher Scientific	20163	The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C).
DynaMag-2,  magnetic stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	–	The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody	Cell Signaling	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody	Rockland	200-301-A87
Secondary goat anti-rabbit antibody	Cell Signaling	7074
Secondary rabbit anti-mouse antibody	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI – 1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
FBS – Filtrated Bovine Serum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin – streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutamine solution (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Glass Plates	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer	Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules	Bio-Rad	1658050
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
PVDF transfer membrane	Perkin Elmer	NEF1002	Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Digital Imager	Vilber	–
RNA oligo synthesis	Mycrosynth AG, Switzerland	–	the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile aliquots to be stored at -20°C
Pierce Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88817	Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate	Sigma-Aldrich	368458
ortho-phosphoric acid	Applichem	A0637