Desthiobiotin-Streptavidin-afinidade mediada purificação de proteínas RNA-interagindo em células mesotelioma

Summary

Desthiobiotin rotulagem de um sintético 25-nucleotide oligo de RNA, que contém um motivo de adenina-rico elemento (são), permite a ligação específica da proteína de ligação são citosólica.

Abstract

O em vitro RNA-pulldown é ainda amplamente usado nos primeiros passos de protocolos que visam identificar RNA-proteínas que reconhecem estruturas de RNA e motivos específicos. Neste protocolo de RNA-pulldown, sondas de RNA sintetizadas comercialmente são rotuladas com uma forma modificada de biotina, desthiobiotin, no terminal 3′ da strand, RNA, que se liga reversivelmente para streptavidin e permite assim a eluição das proteínas sob mais fisiológica condições. O RNA-desthiobiotin está imobilizado através da interação com estreptavidina em grânulos magnéticos, que são usados para puxar para baixo de proteínas que interagem especificamente com o RNA de interesse. Proteínas não-desnaturado e ativas da fracção citosólica de células mesotelioma são utilizadas como fonte de proteínas. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar a interação entre proteínas de ligação de RNA conhecidas e uma 25-nucleotide (nt) longo RNA sonda contendo uma sequência de interesse. Isso é útil para completar a caracterização funcional de estabilização ou desestabilizar os elementos presentes em moléculas de RNA alcançadas usando um ensaio de vetor de repórter.

Introduction

Expressão gênica e o nível final do produto do gene podem ser fortemente regulamentados por afetar a estabilidade do mRNA e o mRNA tradução taxa¹. Estes mecanismos de regulação pós-transcricional são exercidos através de interações de não-codificantes do RNA e/ou ligação de RNA proteínas (RBPs) com mRNA alvo. Geralmente é a região untranslated 3′ do mRNA (3′ UTR – pertencentes à porção não-codificantes do genoma²) que contém específica cis-elementos reguladores (CRE), que são reconhecidos pelo trans-agindo fatores como miRNA ou RBPs ³. o mais bem estudadas cis-elemento dentro do 3′ UTR, é motivo de adenina-rico elemento (são), que é reconhecido por proteínas específicas de AU-ligação (AUBP) e, por sua vez, induz qualquer degradação do mRNA/deadenylation (decaimento são-mediada) ou de estabilização do mRNA⁴.

O tamanho da 3′ UTR de desnutridos mRNA (CALB2) é 573 bp longa e contém um pentâmero AUUUA putativo, como previsto pelos AREsite2, uma ferramenta de bioinformatic⁵. Consistente com a presença de um putativo são motivo, o ensaio de vetor-repórter pmirGLO demonstrado um papel de estabilização deste elemento dentro do mRNA CALB2⁶. Finalmente, o em vitro RNA-pulldown foi usado para identificar a AUBP que estabiliza desnutridos mRNA através do motivo de são.

Desde que todos os RNAs não codificantes interagirem com proteínas⁷, o em vitro RNA-pulldown é um ensaio de primeira escolha para a identificação de RNA-interactianos e boa maneira para ajudar a decifrar os mecanismos moleculares. Neste método de RNA-pulldown, sondas de RNA sintetizadas comercialmente, que foram rotuladas com uma forma modificada de biotina (desthiobiotin) no terminal 3′ da strand, RNA, foram usadas. O RNA-desthiobiotin está imobilizado através da interação com estreptavidina em grânulos magnéticos, que são usados para puxar para baixo de proteínas que interagem especificamente com o limite-RNA de interesse. Proteínas não-desnaturado e ativas da fracção citosólica de células mesotelioma são utilizadas como fonte de proteínas. Essas proteínas RNA-limite são eluídas dos grânulos magnéticos, executado através de um gel de SDS-PAGE 12%, transferido para uma membrana e sondado com anticorpos diferentes.

O procedimento de purificação padrão estreptavidina-biotina afinidade, dura desnaturação requeridas para romper o vínculo forte irreversível biotina-streptavidin para Eluir o limite proteínas⁸, que pode levar a dissociação de complexos de proteínas. Ao contrário de biotina, desthiobiotin reversível vincula streptavidin e competitivos é deslocada com uma solução tamponada de biotina, permitindo a eluição suave de proteínas e evitando o isolamento de naturalmente biotinilado moléculas⁹, sugerindo que a técnica é ideal para isolar os complexos da proteína nativa sob condições nativas.

In vitro as condições de vinculação e o rigor, que são determinados pela concentração de sal, agentes redutores e porcentagem de detergente, devem ser próximo aos presentes no contexto celular a fim de identificar interações de verdade na vivo . As condições de ligação implementadas neste documento foram anteriormente demonstradas conforme apropriado para a identificação da HuR como uma proteína ligadora AU¹⁰. Esta abordagem poderia poupar tempo, desde que a otimização das condições de vinculação adequada pode ser demorada e desafiador. Além disso, esse método poderia ser usado como um protocolo de partida para qualquer experiência de RNA-pulldown e pode ser otimizado progressivamente alterando a concentração de sais e detergentes, mudando a porcentagem de glicerol, e adicionando outros sais. Além disso, demonstrar que mesmo uma curta 25-nucleotídeo do RNA-sonda abrigando um pentâmero são-motivo poderia ser usado para demonstrar a interação com um específico AUBP.

Protocol

1. preparação da fração de proteína citosólica e Nuclear Placa 4 x 106 ACC-MESO-4 células num balão de cultura de célula T150 cultivadas em RPMI – 1640 meio suplementado com 10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina (100 x) e 2 mM L-glutamina (200 mM). Quando as células alcançam uma confluência de 80-90% (~5-5.5 x 106 células), prosseguir com a extração da proteína da fração nuclear e citosólica.Nota: ACC-MESO-4 linha de celular foi obtida o RIKEN BioResource centro<sup…

Representative Results

Neste experimento, utilizou-se um fragmento de tempo 25-nt de desnutridos 3′ UTR abrigando são motivo (CALB2) 3′ UTR (são) 25-nt para testar se liga-se especificamente à proteína antígeno humano-R (HuR), um conhecido estabilizador de mRNA. Para testar a especificidade do elemento são, um RNA 25-nt sonda CALB2 3′ UTR (mtARE) contendo uma mutação são-motivo, que anteriormente foi mostrada para abolir o efeito de estabilização do motivo são, foi usado6. O …

Discussion

3′ UTRs pertencem ao não-codificantes do genoma³, e todos os RNAs não codificantes podem interagir com as proteínas a fim de exercer sua função⁷. Quando o genoma de mamíferos foi encontrado para ser comodamente transcrito e produzido uma parcela significativa de tempo não-codificante RNAs¹⁶, emergentes evidências demonstraram que estes RNAs long-não-codificante função na regulação da expressão gênica como eles interagem com cromatina-r…

Materials

NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit	Thermo Fisher Scientific	20163	The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C).
DynaMag-2,  magnetic stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	–	The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody	Cell Signaling	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody	Rockland	200-301-A87
Secondary goat anti-rabbit antibody	Cell Signaling	7074
Secondary rabbit anti-mouse antibody	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI – 1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
FBS – Filtrated Bovine Serum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin – streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutamine solution (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Glass Plates	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer	Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules	Bio-Rad	1658050
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
PVDF transfer membrane	Perkin Elmer	NEF1002	Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Digital Imager	Vilber	–
RNA oligo synthesis	Mycrosynth AG, Switzerland	–	the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile aliquots to be stored at -20°C
Pierce Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88817	Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate	Sigma-Aldrich	368458
ortho-phosphoric acid	Applichem	A0637