Desthiobiotin стрептавидина близость опосредованной очистки белков взаимодействующих РНК в клетки мезотелиомы
Summary
Desthiobiotin маркировка синтетических 25-нуклеотидов РНК oligo, который содержит элемент аденин-богатые люди (являются) мотив, позволяет конкретной привязки цитозольной являются связывающий белок.
Abstract
В vitro РНК пулдаун до сих пор широко используется в первые шаги протоколов, направленных на выявление RNA-связывая протеинов, которые признают конкретных структур РНК и мотивы. В этом протоколе РНК пулдаун, коммерчески синтезированных РНК зонды помечены с измененной форме биотина, desthiobiotin, на станции 3′ strand РНК, который обратимо связывается с стрептавидина и таким образом позволяет элюции белков под более физиологических условий. РНК desthiobiotin прикол через взаимодействие с стрептавидина на магнитной бусины, которые используются для тянуть вниз белки, которые непосредственно взаимодействуют с РНК интерес. Non денатурированный и активных белков из цитозольной фракции клетки мезотелиомы используются как источник белков. Метод, описанный здесь может применяться для определения взаимодействия между известных РНК связывания белков и 25-нуклеотидов (nt) длиной РНК зонд содержащий последовательность интереса. Это полезно для завершения функциональная характеристика стабилизации или дестабилизирующих элементов, присутствующих в молекулы РНК с помощью пробирного вектор репортер.
Introduction
Экспрессии генов и последний уровень продукта гена могут жестко регулируется, влияющие на стабильность мРНК и мРНК перевод курса1. Эти post-transcriptional механизмы регулирования оказывается через взаимодействие некодирующих РНК и/или RNA-связывая протеинов (ОДП) с Целевая мРНК. Обычно это 3′ непереведенные регионе мРНК (3′ УТР – принадлежащие некодирующих часть генома2), содержащий конкретные СНГ-регуляторных элементов (КРР), которые распознаются транс-действующих факторов, таких как Мирна или ОДП 3. наиболее изученных стран СНГ-элемент внутри 3′ УТР, это аденин богатые элемент (являются) мотив, который распознается по конкретным AU-связывающих белков (AUBP) и, в свою очередь, индуцирует либо деградации мРНК/deadenylation (являются опосредованной распада) или мРНК стабилизации4.
Размер 3′ УТР из calretinin мРНК (CALB2) является 573 bp длинные и содержит предполагаемый AUUUA пентамера, как предсказано, AREsite2, инструмент bioinformatic5. В соответствии с наличием разоблачало это мотив, pmirGLO вектор репортер пробирного продемонстрировал роль по стабилизации этого элемента в мРНК CALB26. Наконец, в пробирке РНК пулдаун была использована для выявления AUBP, которая стабилизирует calretinin мРНК через являются мотивом.
Поскольку все некодирующих RNAs взаимодействуют белки7, в пробирке РНК пулдаун является хорошим способом и assay первого выбора для определения РНК посредники для помощи в расшифровке молекулярных механизмов. В этом методе РНК пулдаун коммерчески синтезированных РНК зондами, которые были помечены с измененной форме биотин (desthiobiotin) в отеле terminus 3′ стренги РНК, были использованы. РНК desthiobiotin прикол через взаимодействие с стрептавидина на магнитной бусины, которые используются для тянуть вниз белки, которые непосредственно взаимодействуют с граница РНК интерес. Non денатурированный и активных белков из цитозольной фракции клетки мезотелиомы используются как источник белков. Такие РНК прыгните белки являются этого eluted от магнитной бусины, запустить через гель SDS-PAGE 12%, переданы мембраны и исследован с различными антителами.
В процедуре очищения сродства стандартных стрептавидина биотин, суровых денатурации необходимые условия сорвать сильный необратимым биотин стрептавидина облигаций для элюировать связанных белков-8, который может привести к диссоциации белковых комплексов. В отличие от биотин desthiobiotin обратимо связывается с стрептавидина и конкурентоспособным перемещенных с буфферезированный раствор биотина, позволяя для нежный элюции белков и избежать изоляции естественно биотинилированным молекул9, Предполагая, что этот метод идеально подходит для изоляции родной белковых комплексов в родной условиях.
В vitro условий привязки и жесткости, которые определяются концентрации соли, восстановителей и стиральный порошок процент, должна быть близка к присутствующим в сотовой связи для того, чтобы определить значение true в естественных условиях взаимодействия. Обязательного условия выполнены здесь были ранее продемонстрированы как пригодные для идентификации HuR как AU-связывания белков10. Этот подход мог бы сэкономить время, поскольку оптимизация условий надлежащего привязки может быть длительным и сложным. Кроме того этот метод может использоваться в качестве отправной протокол для любого эксперимента РНК пулдаун и постепенно может быть оптимизирована путем изменения концентрации солей и моющих средств, изменив процент отведенного под глицерина и добавления других солей. Кроме того мы показали, что даже короткий 25-нуклеотидов РНК зонд укрывательство пентамера являются мотив могут быть использованы для демонстрации взаимодействия с конкретным AUBP.
Protocol
Representative Results
Discussion
3′ необычных принадлежат некодирующих генома3, и все некодирующих РНК может взаимодействовать с белками для того чтобы приложить их функции7. Когда генома млекопитающих было установлено pervasively транскрипции и производится значительная часть длиной некодирующи…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Швейцарский Национальный фонд Синергия науки Грант CRSII3 147697, Stiftung für Krebsforschung изображения и Цюрих Krebsliga.
Materials
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | – | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI – 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS – Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin – streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | – | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | – | the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
Referências
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3′ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
- von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
- Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
- Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- . Magnetic bead technology for better assay development Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013)
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
- Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
