Desthiobiotin-streptavidine-affinité médiée par la Purification des protéines interagissant avec l’ARN dans les cellules de mésothéliome

Summary

Desthiobiotin marquage d’un oligo synthétique de RNA 25 nucléotides, qui contient un motif élément riches adénine (ARE), permet la fixation spécifique de la protéine cytosolique sont.

Abstract

Le in vitro RNA-menu déroulant est encore largement utilisé dans les premières étapes des protocoles visant à identifier des protéines de liaison à l’ARN qui reconnaissent les structures d’ARN spécifiques et les motifs. Dans ce protocole de RNA-pulldown, sondes d’ARN synthétisés dans le commerce sont étiquetés avec une forme modifiée de la biotine, desthiobiotin, à l’extrémité 3′ du brin d’ARN, qui lie réversiblement streptavidine et ainsi permet d’élution des protéines sous plus physiologique conditions. Le RNA-desthiobiotin est immobilisée par une interaction avec la Streptavidine sur billes magnétiques, qui servent à tirer vers le bas de protéines qui interagissent spécifiquement avec l’ARN d’intérêt. Protéines non dénaturé et actives depuis le cytosol des cellules de mésothéliome sont utilisés comme source de protéines. La méthode décrite ici peut être appliquée pour détecter l’interaction entre les protéines de liaison ARN connues et une sonde RNA longue de 25 nucléotides (nt) contenant une séquence d’intérêt. Ceci est utile pour compléter la caractérisation fonctionnelle de stabiliser ou déstabiliser les éléments présents dans les molécules d’ARN obtenus avec un dosage de vecteur de journaliste.

Introduction

L’expression des gènes et le niveau final du produit du gène peuvent être étroitement contrôlées en affectant la stabilité de l’ARNm et l’ARNm traduction taux¹. Ces mécanismes de régulation post-transcriptionnelle sont exercent à travers les interactions des protéines de RNA et/ou de liaison à l’ARN non codants (pratiques commerciales restrictives) avec l’ARNm ciblés. C’est généralement la région non traduite en 3′ de l’ARNm (3′ UTR – appartenant à la partie non codantes du génome²) qui contient des cis-éléments de régulation (CRE), qui sont reconnus par trans-agissant de facteurs tels que miRNA ou de pratiques commerciales restrictives ³. les mieux étudiés cis-élément au sein de la région 3′ UTR, est le motif de l’élément riches adénine (ARE), qui est reconnu par les protéines de liaison AU spécifiques (AUBP) et, à son tour, induit un ARNm dégradation/désadénylation (sont-mediated decay) ou sur la stabilisation de l’ARNm⁴.

La taille de la région 3′ UTR de calretinin (CALB2) d’ARNm est 573 bp long et contient un pentamère AUUUA putatif, tel que prédit par AREsite2, un outil de bioinformatic⁵. Compatibles avec la présence d’un motif sont présumé, le dosage de vecteur-journaliste de pmirGLO ont démontré un rôle dans la stabilisation de cet élément au sein de l’ARNm de CALB2⁶. Enfin, l’ in vitro RNA-menu déroulant servait à identifier le AUBP qui stabilise calretinin ARNm à travers le motif sont.

Étant donné que toutes les ARN non codants interagissent avec les protéines⁷, l’ in vitro RNA-menu déroulant est un bon moyen et des tests de première de choix pour identifier les RNA-Interactiens afin d’aider à décrypter les mécanismes moléculaires. Dans cette méthode de RNA-menu déroulant, des sondes d’ARN synthétisés dans le commerce, qui ont été marquées avec une forme modifiée de biotine (desthiobiotin) à l’extrémité 3′ du brin d’ARN, ont été utilisés. Le RNA-desthiobiotin est immobilisée par une interaction avec la Streptavidine sur billes magnétiques, qui servent à tirer vers le bas qui interagir spécifiquement avec l’ARN d’intérêt lié aux protéines. Protéines non dénaturé et actives depuis le cytosol des cellules de mésothéliome sont utilisés comme source de protéines. Ces protéines liées à RNA sont éluées de billes magnétiques, courir à travers un gel SDS-PAGE de 12 %, transféré sur une membrane et sondés avec anticorps différents.

Dans la procédure de purification d’affinité standard streptavidine-biotine, dénaturation rude conditions sont requises pour perturber la liaison streptavidine-biotine forte irréversible pour éluer les protéines liées⁸, qui pourrait conduire à la dissociation de complexes protéiques. Contrairement à la biotine, desthiobiotin réversible se lie à la Streptavidine et est déplacé de façon compétitive avec une solution tampon de biotine, permettant l’élution douce des protéines et d’éviter l’isolement des naturellement biotinylé molécules⁹, ce qui suggère que la technique est idéale pour isoler les complexes de protéine native sous conditions natives.

In vitro les conditions de la liaison et rigueur, qui sont déterminés par la concentration en sel, agents réducteurs et pourcentage de détergent, devraient être proches de celles présentes dans le contexte cellulaire afin d’identifier les véritables in vivo des interactions. Les conditions de liaison mis en place dans les présentes ont été démontrées précédemment en fonction de l’identification de la HuR comme une protéine de liaison AU¹⁰. Cette approche pourrait gagner du temps, étant donné que l’optimisation des conditions de liaison approprié peut être long et difficile. En outre, cette méthode pourrait être utilisée comme un protocole de départ pour toute expérience de RNA-menu déroulant et optimiser progressivement en changeant la concentration des sels et des détergents, en modifiant le pourcentage de glycérol et en ajoutant autres sels. En outre, nous avons démontré que même une courte 25 nucléotides RNA-sonde contenant un pentamère sont-motif pourrait servir à démontrer l’interaction avec un AUBP spécifique.

Protocol

1. préparation de la Fraction des protéines cytosoliques et nucléaires Plaque 4 x 106 ACC-méso-4 cellules dans un flacon de culture cellulaire T150 cultivées en milieu RPMI – 1640 milieu additionné de 10 % FBS, 1 x pénicilline/streptomycine (x 100) et 2 mM de L-Glutamine (200 mM). Quand les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % (~5-5.5 x 106 cellules), procéder à l’extraction de la protéine de fraction nucléaire et cytosolique.NOTE : Lignée cellulaire ACC-més…

Representative Results

Dans cette expérience, un fragment long de 25-nt du calretinin 3′ UTR hébergeant sont motif (CALB2) 3′ UTR (ARE) 25-nt a été utilisé pour tester si elle se lie spécifiquement à la protéine R homme-antigène (HuR), un stabilisateur d’ARNm connus. Pour tester la spécificité de l’élément sont, un ARN 25-nt sonde CALB2 3′ UTR (mtARE) contenant une mutation sont-motif, qui a été montrée précédemment de supprimer l’effet de stabilisation du motif sont, a été utilisé<su…

Discussion

3′ UTR appartiennent à la non codantes du génome³, et tous les ARN non codants peut interagir avec des protéines afin d’exercer leur fonction⁷. Quand le génome des mammifères s’est avéré être une transcription de l’acte et produit une grande partie du long non codantes ARN¹⁶, nouvelles preuves ont démontré que ces ARN non-codants-long fonctionne dans la régulation de l’expression des gènes qui interagissent avec remodelage de la c…

Materials

NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit	Thermo Fisher Scientific	20163	The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C).
DynaMag-2,  magnetic stand	Thermo Fisher Scientific	12321D
Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	–	The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody	Santa Cruz	8035	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody	Cell Signaling	9542	1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody	Rockland	200-301-A87
Secondary goat anti-rabbit antibody	Cell Signaling	7074
Secondary rabbit anti-mouse antibody	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI – 1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
FBS – Filtrated Bovine Serum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin – streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutamine solution (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Glass Plates	Bio-Rad	1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer	Bio-Rad	1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules	Bio-Rad	1658050
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
PVDF transfer membrane	Perkin Elmer	NEF1002	Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min
Trans-Blot SD semi-dry transfer cell	Bio-Rad	1703940
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Digital Imager	Vilber	–
RNA oligo synthesis	Mycrosynth AG, Switzerland	–	the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Hydrochloric Acid (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile aliquots to be stored at -20°C
Pierce Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88817	Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate	Sigma-Aldrich	368458
ortho-phosphoric acid	Applichem	A0637