Gefractioneerde lymfkliertest speeksel functioneel-diagnostiek via Pilocarpine stimulatie volgende straling
Summary
We presenteren een gedetailleerde aanpak voor het uitvoeren van speeksel inzameling, met inbegrip van lymfkliertest tracheostomy en het isolement van de drie grote speekselklieren.
Abstract
Hyposalivation wordt meestal waargenomen in de auto-immune reactie van het Sjögren syndroom of volgende straling letsel van de grote speekselklieren. In deze gevallen blijven vragen met betrekking tot de pathogenese van de ziekte en effectieve interventies. Een geoptimaliseerde techniek waarmee functionele beoordelingvan de speekselklieren is van onschatbare waarde voor het onderzoeken van exocrine klier biologie, dysfunctie en therapeutics. Hier presenteren we een stapsgewijze aanpak voor het uitvoeren van pilocarpine speeksel secretie, met inbegrip van tracheostomy en de dissectie van de drie grote lymfkliertest speekselklieren gestimuleerd. We detail ook de juiste lymfkliertest hoofd en nek anatomie die toegankelijk is tijdens deze technieken. Deze aanpak is schaalbaar, zodat meerdere muizen tegelijk worden verwerkt dus verbetering van de efficiëntie van de workflow. Wij streven naar het verbeteren van de reproduceerbaarheid van deze methodes, die allemaal verder toepassingen binnen het veld. Naast speeksel collectie bespreken we statistieken voor kwantificeren en normaliseren van de functionele capaciteit van deze weefsels. Representatieve gegevens zijn opgenomen uit submandibulaire klieren met depressief speekselklier functie 2 weken na gefractioneerde straling (4 doses van 6,85 Gy).
Introduction
Speekselklier aandoeningen omvatten syndromen van dysregulated of verminderde secretie leidt tot overproductie (sialorrhea) of Onderdelenoverzicht (xerostomia en hyposalivation) van speeksel1. In beide gevallen is er een belang bij het verbeteren van ons begrip van de speekselklier biologie naar het einddoel van therapeutische ontwikkeling2.
De speekselklieren zijn zeer radiosensitive organen, en vaak zijn beschadigd tijdens het hoofd en de nek kanker radiotherapie, wat leidt tot permanente droge mond (xerostomie)3,4. In tegenstelling tot andere radiosensitive weefsels, echter de Verwerkingsfrequentie van de speekselklier is relatief laag, en het mechanisme van secretoire verlies is slecht begrepen5,6. In de omgeving van deze unieke letsel vereist weefsels regeneratie en stralingsbescherming strategieën speeksel functionele beoordeling. Experimenteel, is lymfkliertest speeksel collectie een bijzonder waardevol instrument bij de evaluatie van de klier reactie op zowel de straling en de therapeutische agenten.
Hier presenteren we een methode voor het uitvoeren en kwantificeren van de secretie van speeksel gestimuleerd met behulp van pilocarpine, een potente muscarinerge agonist7. Pilocarpine stimuleert het autonome zenuwstelsel te induceren klier secretie8,9. Om deze test op passende wijze te voeren, is een tracheostomy nodig om ervoor te zorgen dat de muis onderhoudt een patent luchtwegen gedurende de hele procedure, en verminderen de risico’s van verstikking en aspiratie van gebundelde afscheidingen in de mondholte10.
Dit is een terminal procedure, culminerend in de verwijdering van de drie grote speekselklieren: de oorspeekselklier (PG), de submandibulaire (SMG) en de sublinguaal (SLG). Voor functionele studies, klier gewichten worden opgenomen en worden vaak gebruikt om te normaliseren speeksel meting11,12,13. Deze gegevens zijn bijzonder belangrijk in straling studies, waarin de atrofie van de klier een verwachte uitkomsten14,15 is
Er is variabiliteit in de literatuur met betrekking tot hoe gestimuleerde secretie van speeksel wordt uitgevoerd en gerapporteerd16. Bijvoorbeeld, pilocarpine doses binnen de literatuur bereik ten minste drie ordes van grootte17,18,19,20,21,22,23. Hier presenteren we een geoptimaliseerde hooggedoseerde pilocarpine protocol met de bedoeling van betere reproduceerbaarheid in uitvoering van de methode, evenals het verstrekken van een modulair platform van technieken (tracheostomy speeksel collectie en klier dissectie) die aangepast worden kunnen nodig.
Naast protocol demonstratie omvatten wij representatieve functionele gegevens van speeksel stroom op 2 weken na gefractioneerde straling (4 doses van 6,85 Gy) naar de SMG-regio.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteren een meerstaps methode voor de beoordeling van de speekselklier functie, die kan worden toegepast op de studie van de klier letsel en therapeutics. Onze procedure impliceert tracheostomy, speeksel collectie en klier dissectie, die allemaal experimentele toepassingen die een geïntegreerde studie van biologie van de speekselklier kunnen ondersteunen. Bijvoorbeeld is lymfkliertest tracheostomy gebruikt voor het beheer van de algemene luchtweg tijdens procedures belemmeren de mondholte.
<p class="jove_cont…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het nationale Instituut van Dental en craniofaciale onderzoek (NIDCR) en het National Cancer Institute (NCI) van de National Institutes of Health onder Award nummer R56 DE025098, UG3 DE027695 en CA206296 van de F30. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Dit werk werd ook ondersteund door de NSF DMR-1206219 en de IADR Innovation in mondelinge zorg Award (2016).
Wij wil Dr. Eri Maruyama en Andrew Hollomon bedanken voor hun hulp met speeksel collectie. We zouden graag bedanken Pei-Lun Weng voor zijn hulp met klier dissectie. Wij wil Matthew Ingalls bedanken voor zijn hulp ter voorbereiding van de figuur. We zouden graag bedanken Dr. Elaine Smolock en Emily Wu voor kritische lezing van dit manuscript.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
Referências
- Bradley, P., O’Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
- Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
- Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both?. Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
- Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
- Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
- Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
- Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
- Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
- Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
- Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
- Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
- Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
- Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
- Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
- Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
- Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
- Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
- Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
- Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice–the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
- Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
- Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
- Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
- Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
- Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).
