פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוקם למסירה וירוס מאתר הערמונית. באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, ביטוי גנים או Cre recombinase מסירה, הטכניקה מאפשרת שינוי orthotopic של ביטוי גנים, מיישם מודל העכבר חדשניים עבור סרטן הערמונית.
עם השכיחות הגוברת של סרטן הערמונית, זיהוי של הגידול מנהלי התקנים חדשים או מאפננים היא קריטית. מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMM) עבור סרטן הערמונית מונעים על ידי גידול הטרוגניות ואת הדינמיקה שלה microevolution מורכבים. סרטן הערמונית המסורתית העכבר דגמים הכוללים, בין השאר, germline, הסתרה מותנה, ביטוי הטרנסגניים oncogenes ומודלים xenograft. דור של מוטציות דה נובו מודלים אלה הוא מורכב, זמן רב ויקר. בנוסף, רוב המודלים המסורתיים יעד הרוב המכריע של האפיתל הערמונית, ואילו האדם סרטן הערמונית הוא ידוע להתפתח ארוע בודד ברק תת קבוצה קטנה של תאים. מודלים יקר צריך לדמות לא רק סרטן הערמונית חניכה, אלא גם סדר מחלה מתקדמת.
כאן נתאר שיטת למטרה מספר תאי האפיתל הערמונית על ידי תאים transducing על ידי נגיפים. המשלוח של וירוס מהונדס הערמונית מאתר מאפשרת שינוי של ביטוי גנים epithelia הערמונית. וירוס סוג וכמות בזאת יגדירו את מספר תאים ממוקדות עבור שינוי גנטי על ידי transducing כמה תאים לטקס החניכה סרטן ותאים רבים עבור ריפוי גנטי. באמצעות הזרקת המבוסס על ניתוח באונה הקדמי, דיסטלי מן המסלול בדרכי השתן, הגידול במודל זה ניתן להרחיב מבלי ופוגע הפונקציה השתן של החיה. יתר על כן, על ידי מיקוד רק ערכת משנה של הערמונית תאים אפיתל הטכניקה מאפשר משובט הרחבה של הגידול, ולכן מחקה גידול אנושי חניכה, התקדמות, כמו גם פלישה דרך קרום הבסיס.
טכניקה חדשנית זו מספק מודל חזק סרטן הערמונית עם שיפור הרלוונטיות פיזיולוגיים. סבלם של בעלי החיים היא מוגבלת, שכן אין גידול נוסף נדרש, מונה בסך הכל בעלי חיים מצטמצם. באותו הזמן, ניתוח של גנים מועמדים חדשים מסלולים היא מואצת, וזה בתורו עלות גבוהה יותר יעיל.
זיהוי וטיפול בסרטן הערמונית השתפרו משמעותית בעשור האחרון. ובכל זאת, השכיחות של סרטן הערמונית עולה, בעקבות תוחלת החיים. משוערת 1.1 מיליון מקרים חדשים ברחבי העולם, זה בין הסיבות הנפוצות ביותר של מוות מסרטן גברים 1. סרטן הערמונית הוא איטי בהתפתחות שלו, אך כאשר הסרטן התפתחה למצב גרורתי מתקדם, הפרוגנוזה הוא עני בשל אפשרויות הטיפול מוגבל. עד כה, רק כמה גנים זוהו מנהלי התקנים נפוצים ב סרטן זה, ופוגע שלה הטרוגניות, multifocality זיהוי של סמנים ביולוגיים, מחלת targetable מנהלי התקנים2,3.
לטכניקות GEMMs ביצירת הם לעיתים קרובות לקוי על ידי המורכבות שלהם, הוצאות בזמן ועלויות. מודלים נוקאאוט מותנה היה בשימוש נרחב לחקר סרטן הערמונית המועמד גנים, כי התוצאה עובריים קטלני כאשר לא פעיל ב germline4. הדגמים הנפוצים ביותר לערב של recombinase Cre ספציפיים הערמונית מושפעת גם ששונה Probasin5 או מקדם6 PSA משולב של GEMM על ידי הצלב מטלטלין נוספים. דגמים אלה, הגן עניין יהיה ממוקד ברוב המכריע של הערמונית תאים אפיתל, יצירת היפרפלזיה האיבר כולו, אשר עשוי לפגום של החיה בדרכי השתן פונקציה7.
משלוח ויראלי של החלבון Cre בזריקה לתוך האונה הקדמי של הערמונית מאתר ניתן לפתור בעיה זו על ידי מיקוד רק תאים מספר8. התחשבות דרישות טכניות מעבדות, מומחיות, מטרות, יתרונות שיטת מקשת רחבה של ווריאציות אפשריות. גישות מוצלחת ניצול אדנו מיקוד JunB , Pten9 או Lentivirus מיקוד Pten ו- Trp5310 הוכחו בין השאר. הוספת transgenes, כגון לוציפראז, הבונה ויראלי או GEMM את יתר על כן תאפשר פולשני ניטור של התקדמות המחלה באמצעות ביולומינסנציה הדמיה11.
הגנום עריכה מבוסס על טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מגלה הזדמנות חדשה ומהירה ללמוד סרטן באמצעות יצירה מהירה של הסתרה סומאטית12. משלוח ויראלי של מדריך בודד RNAs (sgRNAs) למזהים ייחודיים של האונה הקדמי של הערמונית מאתר יוצר מודל פיזיולוגית רלוונטיים יותר של סרטן הערמונית. בכך תאים בודדים נשיאת מוטציות שבחרת יכולים ליצור שיבוטים מסוגלים התפשטות ופלישה. יתר על כן, השימוש מדריך RNAs עבור גנים יעד מרובים יפיק שיבוטים תאים עם שינויים בגנים שונים. פעולה זו תאפשר גידול הטרוגניות, לחץ הברירה הטבעית על התקדמות סרטן, אשר יכול לחשוף את החשיבות של כל שינוי גנטי או מנגנונים epistatic.
כאן אנו מציגים שיטה להעביר נגיפים הערמונית מאתר עבור שינוי של ביטוי גנים. בטן חתך קטן, האונה הערמונית הקדמי מאתר חשוף, נגיפים מוזרקים לתוך האונה. חמישה ימים לאחר הניתוח, ניתוח קליפים ניתן להסיר מן העור, ניתן לנתח את סרטן הערמונית מ- 8 שבועות לאחר. בסך הכל, זה הליך מהיר וחסכוני, יש השפעה קטנה על העכבר ומאפשר הגידול גדול יותר לפתח מבלי להתפשר על העכבר.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לשנות ביטוי גנים באונה הקדמי של הערמונית מאתר באמצעות הזרקת וירוס, יצירת מודל חזק עכבר חדש עבור סרטן הערמונית (איור 2). ניהול מוצלח אדנו תוארה לראשונה על ידי Leow et al. . ב- 2005-8. בעבר הראינו איך קידוד אדנו Cre recombinase חלבון יכול להחליף ?…
The authors have nothing to disclose.
מר מומן על ידי התחברות של האגודה למלחמה בסרטן הדני (R146-A9394-16-S2). MFB ו MKT היו ממומן על-ידי AUFF נובה (AUFF-E-2015-FLS-9-8). מר MFB משותפת, במימון בית הספר, בריאות, AU. המעבדה E.F.W. נתמך על ידי מענקים ממשרד ספרדית של הכלכלה (SAF2015-70857, שותפה במימון על ידי ERDF-האיחוד האירופי), של ERC מתקדם גרנט (741888 – CSI-Fun).
אנחנו רוצים להודות ליליאנה Fajardo מלור (גנים, פיתוח ומחלות; לחקר הסרטן הלאומי) לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Equipment | |||
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
Heating pad | multiple suppliers | ||
Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
Microscope | Leica | different models have been used | |
Reagents | |||
1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
Antisedan | obtained from the animal facility | ||
Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
Midazolam | obtained from the animal facility | ||
100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
Eye ointment | Takeda | 7242 | |
Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |