Virus levering af CRISPR Guides til Murine prostata for gen ændring
Summary
Denne protokol beskriver en nyetableret metode til virus levering til murine prostata. Bruger CRISPR/Cas9 teknologi, gen overekspression eller Cre recombinase levering, teknikken tillader orthotopic ændring af genekspression og implementerer en roman musemodel for prostatakræft.
Abstract
Med en stigende forekomst af prostatakræft er identifikation af nye tumor drivere eller modulatorer afgørende. Genetisk modificerede musemodeller (CLAUSS) for prostatakræft er hæmmet af tumor heterogenitet og dens komplekse mikroevolution dynamik. Traditionelle prostatakræft musemodeller omfatter blandt andet kønscelleoverførsel og betinget knockouts, transgene udtryk af onkogener og xenograft modeller. Generation af de novo mutationer i disse modeller er komplekse, tidskrævende og dyrt. Derudover målrette de fleste af traditionelle modeller størstedelen af prostata epitel, der henviser til, at menneskers prostatakræft er kendt for at udvikle sig som en isoleret hændelse i kun en lille delmængde af celler. Værdifulde modeller skal simulere prostatakræft indledning, men også progression til fremskreden sygdom.
Her beskriver vi en metode til at målrette et par celler i prostata epitel af transducing celler af virale partikler. Levering af en manipuleret virus til murine prostata tillader ændring af genekspression i prostata epitheler. Virustype og mængde vil hermed definerer antallet af målrettede celler for gen ændring ved transducing et par celler for kræft indledning og mange celler for genterapi. Gennem kirurgi-baserede injektion i den forreste lap, distale fra urin track kan tumor i denne model udvide uden forringer funktionen urin af dyret. Derudover ved at målrette kun en delmængde af prostata epitelceller teknikken muliggør klonal ekspansion af tumor, og derfor efterligner human tumor indledning samt progression og invasion gennem den basale membran.
Denne nye teknik giver en kraftfuld prostatakræft model med forbedret fysiologiske relevans. Dyrenes lidelser er begrænset, og da der kræves ingen yderligere avl, samlede animalske count er reduceret. På samme tid, er analyse af nye kandidat gener og veje accelereret, som igen er mere omkostningseffektiv.
Introduction
Påvisning og behandling af prostata cancer har væsentligt forbedret i det seneste årti. Stadig, stiger forekomsten af prostatakræft, efter levetid. Med en anslået 1,1 millioner nye tilfælde på verdensplan er det blandt de mest almindelige årsager til cancer-relaterede dødsfald i mænd 1. Prostatakræft er sen i sin udvikling, men når kræften har udviklet sig til en avanceret metastatisk tilstand, prognosen er dårlig på grund af begrænsede behandlingsmuligheder. Hidtil har kun et par gener er blevet identificeret som fælles drivere i denne kræft, og dens heterogenitet og multifocality hindrer påvisning af biomarkører og markedssegment sygdom drivere2,3.
Klassiske teknikker til at generere GEMMs er ofte hæmmes af deres kompleksitet, rettidig udgifter og omkostninger. Betinget knockout modeller har været udbredt at studere prostatakræft kandidat gener, der resulterer i embryonale dødelighed når inaktiveret i kønscelleoverførsel4. Mest almindelige modeller omfatter en prostata-specifikt Cre recombinase drevet af enten en modificeret Probasin5 eller en PSA6 promotor integreret i CLAUSS af yderligere krydsbestøvning. I disse modeller, vil være målrettet gen af interesse i de fleste af prostata epitelceller, generere hyperplasi i hele organ, som kan forringe dyrets urinveje funktion7.
Viral levering af Cre protein ved indsprøjtning i den forreste lap af murine prostata kan løse dette problem ved at målrette kun få celler8. Hensyntagen til laboratorier tekniske forudsætninger, ekspertise og mål, metode fordele fra en bred vifte af mulige variationer. Vellykkede tilgange udnytte Adenovirus rettet mod JunB og Yvonne_h_p9 eller Lentivirus målretning Yvonne_h_p og Trp5310 har været vist bl.a. Tilføje transgener, såsom luciferase, viral konstruktionen eller CLAUSS vil desuden gøre det non-invasiv overvågning af sygdomsprogression via bioluminescens imaging11.
Genom-redigering baseret på CRISPR/Cas9-teknologi afslører en ny og hurtig mulighed for at studere kræft gennem hurtige generation af somatiske knockouts12. Viral levering af enkelt guide RNA’er (sgRNAs) rettet mod den forreste lap af murine prostata etablerer en fysiologisk mere relevante model af prostatakræft. På denne måde, kan enkelt celler transporterer valgte mutationer danne kloner, der er i stand til ekspansion og invasion. Desuden vil brug af guide RNA’er for flere mål gener generere celle kloner med ændringer i forskellige gener. Dette vil tillade tumor heterogenitet og en naturlig udvælgelse pres på kræft progression, der kan afsløre betydningen af hvert gen ændring eller epistatic mekanismer.
Her vil vi præsentere en metode til at levere viruspartikler til murine prostata for ændring af genekspression. Ved en små abdominale snit, den murine forreste prostata lap er udsat og viruspartikler er sprøjtet ind i lap. Fem dage efter operationen, kirurgiske clips kan fjernes fra huden, og prostata kræft kan analyseres fra 8 uger efter. Samlet set er dette en hurtig og omkostningseffektiv procedure, som har ringe indflydelse på musen og giver mulighed for større tumor udvikle sig uden at gå på kompromis med musen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol beskriver vi en metode til at ændre genekspression i den forreste lap af murine prostata af virus injektion, at skabe en kraftfuld ny musemodel for prostatakræft (figur 2). Succesfuld administration af en Adenovirus blev første gang beskrevet af dishtvserver et al. 20058. Vi har tidligere vist, hvordan en Adenovirus kodning for en Cre recombinase protein kan erstatte tidskrævende krydsning af en Cre allel for væv-specifikke sletning <sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hr. blev finansieret af et stipendium fra Kræftens Bekæmpelse (R146-A9394-16-S2). MFB og MKT blev finansieret af AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Hr. og MFB var medfi nansieret af Graduate School, sundhed, AU. E.F.W. laboratorium understøttes af tilskud fra det spanske ministerium for økonomi (SAF2015-70857, medfinansieres af EFRU-EU) og en ERC advanced grant (741888 – CSI-sjov).
Vi vil gerne takke Liliana Fajardo Mellor (gener, udvikling og sygdom; National Cancer Research Center) for kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
Referências
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
