Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine neu gegründete Methode für Virus-Lieferung an der murinen Prostata. Mit CRISPR/Cas9 Technologie, Überexpression des Gens oder Cre-Rekombinase-Lieferung, die Technik erlaubt orthotopen Veränderung der Genexpression und implementiert eine neue Maus-Modell für Prostatakrebs.
Abstract
Mit einer steigenden Inzidenz von Prostatakrebs ist die Identifizierung der Tumor Fahranfänger oder Modulatoren entscheidend. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) für Prostatakrebs sind durch Tumor Heterogenität und seine komplexe Mikroevolution Dynamik erschwert. Traditionelle Prostatakrebs-Maus-Modellen gehören unter anderem Keimbahn und bedingte Knockouts, transgene Ausdruck der Onkogene und Xenograft-Modelle. Generation von de Novo Mutationen in diesen Modellen ist komplex, zeitaufwändig und kostspielig. Darüber hinaus zielen die meisten traditionellen Modelle den Großteil der Prostata Epithel, während menschlichen Prostata-Krebs ist bekannt als ein isoliertes Ereignis in nur eine kleine Teilmenge von Zellen zu entwickeln. Wertvolle Modelle müssen jedoch nicht nur Prostatakrebs Einleitung auch Progression zu fortgeschrittener Erkrankung zu simulieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, um ein paar Zellen in der Prostata Epithel durch 3D-Steuerung Zellen nach Viruspartikel zu adressieren. Die Lieferung eines veränderter Virus an der murinen Prostata ermöglicht Änderung der Genexpression in der Prostata Epithelien. Virus-Typ und die Menge werden hiermit die Anzahl der Zellen zielgerichtet für gen-Änderung definieren, indem transducing ein paar für Krebs Einleitung und viele Zellen für die Gentherapie. Durch Chirurgie-basierte Injektion in die vorderen Lappen, distale aus dem Harn Track kann der Tumor in diesem Modell erweitern, ohne Beeinträchtigung der harnfunktion des Tieres. Darüber hinaus durch die Ausrichtung auf nur eine Teilmenge der epithelialen Zellen der Prostata die Technik ermöglicht klonalen Expansion des Tumors und daher imitiert menschliche Tumorentstehung sowie Verlauf und Invasion durch die Basalmembran.
Diese neuartige Technik bietet eine leistungsstarke Prostatakrebs Modell verbesserte physiologische Relevanz. Leiden der Tiere ist begrenzt, und da keine zusätzliche Zucht erforderlich ist, insgesamt tierischen Graf wird reduziert. Zur gleichen Zeit wird Analyse neue Kandidatengene und Wege beschleunigt, die wiederum ist kostengünstiger.
Introduction
Erkennung und Behandlung von Prostatakrebs haben in den letzten zehn Jahren deutlich verbessert. Dennoch steigt die Inzidenz von Prostatakrebs nach Lebenserwartung. Mit schätzungsweise 1,1 Millionen neue Fälle weltweit gehört er zu den häufigsten Ursachen für krebsbedingte Todesursache bei Männern 1. Prostatakrebs ist in seiner Entwicklung langsam, aber wenn der Krebs in einem fortgeschrittenen metastasierten Stadium fortgeschritten ist, die Prognose ist schlecht aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Bisher nur wenige Gene wurden als gemeinsame Treiber in diesem Krebs identifiziert und ihre Heterogenität und Multifocality behindert Nachweis von Biomarkern und Aktionsleisten Krankheit Treiber2,3.
Klassische Techniken der Erzeugung von GEMMs werden durch ihre Komplexität, rechtzeitige Aufwendungen und Kosten oft beeinträchtigt. Bedingte ko-Modelle wurden weithin zur Prostatakrebs Kandidatengene, studieren, die embryonale Tödlichkeit, wenn in der Keimbahn4inaktiviert führen. Alle gängigen Modelle beinhalten eine Prostata-spezifisches-Cre-Rekombinase angetrieben entweder durch eine modifizierte Probasin5 oder integriert in die GEMM durch zusätzliche Kreuzungszüchtung PSA6 Förderer. In diesen Modellen wird das Gen des Interesses gezielt in der Mehrzahl der epithelialen Zellen der Prostata, Erzeugung von Hyperplasie in das ganze Organ, das das Tier Harnwege Funktion7beeinträchtigen kann.
Virale Lieferung des Cre-Proteins durch Injektion in den vorderen Lappen der murinen Prostata kann dieses Problem beheben, indem Sie nur auf ein paar Zellen8. Unter Berücksichtigung Labors technische Voraussetzungen, Know-how und Ziele der Methode profitiert eine Vielzahl von Variationsmöglichkeiten. Erfolgreiche Ansätze nutzen Adenovirus Ausrichtung auf JunB und Pten9 oder Lentivirus targeting Pten und Trp5310 wurden unter anderem gezeigt. Transgene wie Luciferase, das virale Konstrukt oder die GEMM hinzugefügt ermöglicht außerdem nicht-invasive Überwachung des Fortschreitens der Krankheit über Biolumineszenz imaging11.
Genom-Bearbeitung auf der CRISPR/Cas9-Technologie basiert, zeigt eine neue und schnelle Möglichkeit, Krebs durch schnelle Generierung von somatischen Knockouts12zu studieren. Virale Lieferung von einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) an der vorderen Lappen der murinen Prostata gerichtet schafft ein physiologisch relevanter Modell von Prostata-Krebs. Auf diese Weise können Einzelzellen mit ausgewählten Mutationen Klone bilden, die in der Lage sind der Ausbau und die Invasion. Darüber hinaus generiert Verwendung des Guide RNAs für mehrere Zielgene zellklonen mit Veränderungen in verschiedenen Genen. Tumor Heterogenität und einer natürlichen Selektionsdruck wird auf Tumorprogression, dadurch die Bedeutung der einzelnen Gen Veränderung oder epistatic Mechanismen aufdecken können.
Hier präsentieren wir eine Methode um Viruspartikel an der murinen Prostata für Änderung der Genexpression zu liefern. Durch einen kleinen Bauchschnitt der murine anteriore Prostate Lappen ist ausgesetzt und virale Partikel in der Lappen eingespritzt werden. Fünf Tage nach der Operation, chirurgische Clips aus der Haut entfernt werden können und der Prostata Krebs ab 8 Wochen nach analysiert werden kann. Insgesamt ist dies eine schnelle und kostengünstige Verfahren, das hat wenig Einfluss auf die Maus und ermöglicht größere Tumor zu entwickeln, ohne Kompromisse bei der Maus.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode um die Genexpression in der vorderen Lappen der murinen Prostata durch Virus Injektion zu ändern, erstellen ein leistungsfähiges neues Mausmodell für Prostatakrebs (Abbildung 2). Die erfolgreiche Verwaltung eines Adenovirus wurde erstmals von Leow Et Al. 20058beschrieben. Wir haben bereits gezeigt, wie ein Adenovirus-Codierung für eine Cre-Rekombinase-Protein zeitraubende Kreuzung eine Cre-Allel für gewebe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Herr wurde durch ein Stipendium von der dänischen Krebsgesellschaft (R146-A9394-16-S2) finanziert. MFB und MKT wurden durch AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) finanziert. Herr und MFB wurden von Graduate School, Gesundheit, AU mitfinanziert. Das E.F.W. Labor wird unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wirtschaft (SAF2015-70857, mitfinanziert von der EFRE-EU) und eine ERC advanced Grant (741888 – CSI-Fun).
Wir wollen danken Liliana Fajardo Mellor (Gene, Entwicklung und Krankheit; National Cancer Research Center) für kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
Referências
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