Consegna di virus di CRISPR guide alla prostata per alterazione del Gene murina
Summary
Questo protocollo descrive un metodo neoformato per la consegna di virus alla prostata murina. Utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, sovraespressione genica o consegna di Cre ricombinasi, la tecnica permette di orthotopic alterazione dell’espressione genica e implementa nuovi modelli murini per carcinoma della prostata.
Abstract
Con una crescente incidenza di carcinoma della prostata, identificazione di nuovi driver di tumore o modulatori è fondamentale. Modelli murini geneticamente (GEMM) per carcinoma della prostata sono ostacolati dalla eterogeneità del tumore e delle sue dinamiche complesse microevoluzione. Modelli di mouse tradizionale del carcinoma della prostata includono, tra gli altri, germinale e condizionale Ko, transgenici espressione di oncogeni e di modelli di xenotrapianto. Generazione di mutazioni de novo in questi modelli è complesso, lungo e costoso. Inoltre, la maggior parte dei modelli tradizionali di destinazione la maggior parte dell’epitelio della prostata, considerando che ben nota ad evolversi come un evento isolato in solo un piccolo sottoinsieme delle cellule umane del cancro della prostata. Preziosi modelli bisogno di simulare non solo l’inizio del cancro della prostata, ma anche la progressione di malattia avanzata.
Qui descriviamo un metodo per indirizzare alcune cellule nell’epitelio della prostata di cellule di trasduzione di particelle virali. La consegna di un virus artificiale alla prostata murina consente l’alterazione dell’espressione genica negli epiteli della prostata. Quantità e tipo di virus definirà dichiara il numero delle cellule mirati per alterazione del gene di trasdurre poche cellule per l’inizio del cancro e molte cellule per la terapia genica. Attraverso iniezione a base di chirurgia nel lobo anteriore, distale dal tratto urinario, il tumore in questo modello può espandersi senza alterare la funzione urinaria dell’animale. Inoltre, prendendo di mira solo un sottoinsieme delle cellule epiteliali della prostata la tecnica consente l’espansione clonale del tumore e quindi imita l’inizio del tumore umano, progressione, come pure invasione attraverso la membrana basale.
Questa tecnica novella fornisce un modello potente del cancro della prostata con maggiore rilevanza fisiologica. Sofferenza animale è limitata, e poiché nessun allevamento aggiuntivo è richiesto, conteggio nel complesso animale è ridotto. Allo stesso tempo, analisi di nuovi geni candidati e pathways sono accelerato, che a sua volta è più conveniente.
Introduction
Rilevamento e trattamento di carcinoma della prostata hanno migliorato significativamente nell’ultimo decennio. Ancora, l’incidenza di carcinoma della prostata è in aumento, a seguito di aspettativa di vita. Con 1,1 milioni nuovi casi stimati in tutto il mondo, è tra le cause più comuni di morte per cancro in uomini 1. Carcinoma della prostata è lento nel suo sviluppo, ma quando il tumore è progredito ad uno stato metastatico avanzato, la prognosi è sfavorevole a causa di limitate opzioni di trattamento. Finora, solo pochi geni sono stati identificati come driver comuni in questo tipo di tumore, e ostacola la sua eterogeneità e la multifocalità rilevazione di biomarcatori e indirizzabile malattia driver2,3.
Tecniche classiche di generazione GEMM sono spesso alterati dalla loro complessità, tempestive spese e costi. Modelli di knockout condizionale sono stati ampiamente usati per lo studio di geni candidati di carcinoma della prostata, che si traducono in mortalità embrionale quando inattivato in germline4. Modelli più comuni coinvolgono un ricombinasi Cre di prostatico specifico guidato da uno un probasina modificato5 o un promotore PSA6 integrato nella GEMM da ulteriori incroci. In questi modelli, il gene di interesse sarà mirato nella maggior parte delle cellule epiteliali della prostata, generando l’iperplasia nell’intero organo, che può compromettere apparato urinario funzione7 dell’animale.
Consegna virale della proteina Cre tramite iniezione nel lobo anteriore della prostata murina può risolvere il problema prendendo di mira solo poche cellule8. Prerequisiti tecnici laboratori, competenze e obiettivi tenendo conto, i benefici di metodo da una vasta gamma di possibili variazioni. Approcci di successo utilizzando Adenovirus targeting JunB e Pten9 o Lentivirus targeting Pten e Trp5310 sono stati indicati tra gli altri. L’aggiunta di transgeni, quali luciferasi, il costrutto virale o la GEMM permetterà inoltre monitoraggio non invasivo della progressione della malattia tramite bioluminescenza11di imaging.
L’editing genomico basato sulla tecnologia CRISPR/Cas9 rivela una nuova e rapida possibilità di studiare cancro attraverso la rapida generazione di Knockout somatico12. Consegna virale del RNA guida singola (sgRNAs) diretto al lobo anteriore della prostata murino stabilisce un modello fisiologicamente più rilevante di carcinoma della prostata. Con questo mezzo, singole cellule portatrici di mutazioni selezionate possono formare cloni che sono in grado di espansione e di invasione. Inoltre, uso di guida RNAs per più geni bersaglio genererà cloni delle cellule con alterazioni in geni differenti. Ciò consentirà eterogeneità del tumore e una pressione di selezione naturale sulla progressione del cancro, che può rivelare l’importanza di ogni alterazione genica o meccanismi epistatiche.
Qui presentiamo un metodo per fornire le particelle virali alla prostata murina per alterazione dell’espressione genica. Da una piccola incisione addominale, murino lobo anteriore della prostata è esposta e le particelle virali sono iniettate nel lobo. Cinque giorni dopo l’intervento, chirurgico clip possono essere rimossi dalla pelle e il cancro prostatico può essere analizzato da 8 settimane dopo. Nel complesso, questa è una procedura rapida ed economica, che ha poco impatto sul mouse e permette più grande tumore a sviluppare senza compromettere il mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, descriviamo un metodo per alterare l’espressione genica nel lobo anteriore della prostata murina mediante iniezione di virus, creando un potente nuovo modello murino per carcinoma della prostata (Figura 2). La riuscita amministrazione di un Adenovirus in primo luogo è stato descritto da Leow et al. 20058. Precedentemente abbiamo indicato come un Adenovirus che codifica per una proteina di ricombinasi Cre può sostituire richiede tempo i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MR è stato finanziato da una borsa di studio dalla Danish cancer society (R146-A9394-16-S2). MFB e MKT sono stati finanziati da AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). MR e MFB sono stati co-finanziati dalla Graduate School, salute, AU. Il laboratorio E.F.W. è supportato da sovvenzioni dal Ministero spagnolo dell’economia (SAF2015-70857, co-finanziato dal FESR-UE) e un ERC advanced grant (741888 – CSI-Fun).
Vogliamo ringraziare Liliana Fajardo Mellor (geni, lo sviluppo e la malattia; National Cancer Research Center) per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
Referências
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
